Для начала возьмите культивируемые клетки эпителия яичников мыши. Удалите питательную среду из чашек Петри и дважды промойте DPBS. Добавьте 20 миллилитров модифицированной орлиной среды Dulbecco без FBS и раствора пенициллин-стрептомицина.
Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 48 часов. Затем соберите надосадочную жидкость клеточной культуры из 20 чашек Петри 15-сантиметрового диаметра. Центрифугируйте при 300 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и соберите надосадочную жидкость.
Центрифугируйте надосадочную жидкость при температуре 2000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и соберите надосадочную жидкость для удаления клеточного мусора. Теперь включите вакуумный насос и подключите его к воздухозаборнику системы вакуумной фильтрации. Фильтруйте надосадочную жидкость через мембрану из полиэфирсульфона толщиной 0,22 микрона, чтобы удалить везикулы или примеси размером более 0,22 микрона.
Добавьте 15 миллилитров отфильтрованной надосадочной жидкости во внутреннюю трубку 100-килодальтонной ультрафильтрационной трубки. Центрифугируйте при 3 500 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем извлеките жидкость из наружной трубки.
Далее соберите жидкость из внутренней трубки. Добавьте один миллилитр DPBS во внутреннюю трубку. Пипетка повторяется, чтобы ресуспендировать экзосомы, а затем собирать их.
Центрифугируйте жидкость при 10 000 G в течение 60 минут при четырех градусах Цельсия. Переложите надосадочную жидкость в шестимиллилитровую быстрозащелкивающуюся центрифужную пробирку и запечатайте ее термосварщиком. Разрежьте пробирку после ультрацентрифугирования надосадочной жидкости в течение двух часов.
После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах DPBS для получения раствора экзосомы.
