И. М. поддерживается Мари Кюри реинтеграции гранта. Эта работа была поддержана Израиль науке нет фонда Грант. 1146/08, по Хелен и Мартина Киммел Институт Исследования стволовых клеток в Институт Вейцмана и Лир благотворительный фонд.

1. Яйцо укладки <ol><li> За пять дней до вскрытия: разрешить повязана самок откладывают яйца в течение 2-4 часов на свежие продукты питания дополнена с дрожжами. Чтобы получить синхронизированы и хорошо развитые личинки, важно не иметь переполненных культурный (около 30 яиц / 25mm флакон). Как правило, 7-16 женщин используются на флакон, в зависимости от того, насколько хорошо они лежали. </li></ol> 2. Выбор личинки <ol><li> Подготовка 9-а стекло рассекает блюдо заполнено средой Рингера (128 мм NaCl, 2 мМ KCl, CaCl 2 1,8 мм, 4 мм MgCl 2, 35.5mM сахарозы, 5 мМ рН Hepes 6.9). </li><li> Подготовка ячейки сита в шесть-луночного планшета среде, содержащей Рингера и поместите его на лед. Кроме того, мы используем специально изготовленные формы оснащены нейлоновой сетки. </li><li> Выберите приурочен личинок из флакона стен с использованием тонких биологических пинцет (щипцы) и поместите их в сдерживании рассекает блюдо Рингера. </li><li> Передача женщин личинки к чистой хорошо. Мы различаем самок от самцов по их половых желез. Мужские яички легко идентифицируются как большие ясно овалы встроенный в задней трети жира в организме. Женские яичники, расположенный в той же части жира в организме, могут быть идентифицированы как гораздо меньше, ясные, круглые сферах. </li></ol> 3. Препарирование личинка <ol><li> Держите личинки вниз только сзади мозга щипцами и удалить голову вторая пара щипцов. </li><li> Положите оставшиеся задней части на спинной стороне, с трахее вниз. </li><li> Держите личинки задних дыхальца с одной парой щипцов и толкать ее внутрь медленно, в то время как другая пара скользит кутикулу назад, пока примерно половина тела личинки жира всплывает. </li><li> Крепко держите заднему концу и использовать другую пару щипцов, чтобы свободно провести кутикулы. Аккуратно и медленно тронуться с места задним концом так, что кутикула и прилагается слайд кишечника через щель. В конце этого процесса, жира должно быть полностью отделено от кишечника и кутикулы. Отключите кишечник от передней части жира в организме. Для окрашивания и монтажа проще, важно, чтобы жир остался нетронутым. </li><li> Влажные пастбище пипеткой тщательно со средним Рингера, предпочтительно также содержащие расчлененный личинок. Это помогает пальто пипетки и предотвращает жира от прилипания к ним. Использование пастбищ пипетки для передачи жира в организме в среду Ringer ледяной в ячейки фильтра. </li></ol> 4. Фиксация и Окрашивание Все действия выполняются при комнатной температуре, за исключением первой инкубации с антителом, при 4 ° C. <ol><li> Инкубируйте жира в 5% формальдегида в среде Рингера. в течение 20 минут с нежным агитации. </li><li> Промыть в течение 5 минут с 1% PBT (1% Тритон Х-100 в PBS). Повторите это действие в течение 10 минут и третий раз в течение 45 минут. 1% Тритон Х-100 требуется для перфорации личиночной яичника и позволяют антител к проникнуть в нее. </li><li> Блок с 0,3% PBTB (0,3% Тритон Х-100 и 1% BSA в PBS) в течение 1 часа с нежным агитации </li><li> Инкубируйте с желаемым 1-й антител разводят в 0,3% PBTB в течение ночи при 4 ° С с нежным агитации. Этот шаг обычно выполняется в 0,2 мл трубок на роликах. </li><li> Передача жира тело обратно в камеру фильтры. </li><li> Промыть 3 раза, 30 минут каждый, с 0,3% PBTB с нежным агитации. </li><li> Блок с 0,3% PBTB с добавлением 5% нормальных осла сыворотке в течение 1 часа с нежным агитации. </li><li> Инкубируйте с соответствующими вторичными антителами разводненная (в соответствии со спецификацией производителя) в блокирующий раствор (0,3% PBTB с добавлением 5% нормальной сыворотки осла в 0,3% PBT) в течение 2 часов с нежным агитации. Если антитела люминесцентные, инкубировать в темноте с этого момента. Этот шаг обычно выполняется в 0,2 мл трубок на роликах. </li><li> Промыть 3 раза по 30 минут каждая с 0,3% PBT с нежным агитации. </li></ol> 5. Монтаж <ol><li> Передача жира в организме в чистую пробирку Эппендорф. Очень тщательно удалите все жидкости подальше и сразу же накрыть Vectashield монтажа средств массовой информации. Мы используем vectashield регулярно, поскольку он не затвердевает в то время как яичники, отделившись от жира в организме. Образцы могут храниться при монтаже средств массовой информации при 4 ° С не более недели. </li><li> Отрежьте конец кончиком пипетки и использовать его для передачи тщательно жира в организме с минимальным объемом монтажных средств массовой информации (около 30 мкл для 30мм покровное стекло) на предметное стекло. </li><li> Используйте две никелированные держателей контактный, держа 0,1 мм в диаметре контакты распространяться жира в организме. Яичники расположены в задней трети жира в организме. Жира в организме, что их окружает, как правило, форму &#39;цветок&#39;. Это помогает определить расположение яичников. Рассеките из &quot;цветы&quot; от остального жира в организме и выбросить последнего. </li><li> Удаление жира surro телаunding гонады путем скрещивания два контакта тщательно вокруг него. Место изолированных гонады на слайде от жира остаток тела. </li><li> Накрыть крышкой и скольжения печать с лаком для ногтей. </li><li> Визуализируйте непосредственно с помощью конфокальной микроскопии. Образцы могут храниться при температуре 4 ° С на срок до трех недель. </li></ol> 6. Представитель Результаты Мы использовали выше протокол последовать создание нескольких клеточных поколений в яичнике соматические, в том числе GSCs и их соматического ниши. Для этой цели мы используем специфические антитела и маркеры, чтобы различать различные типы клеток в развивающемся гонады. Здесь мы показываем пример двух LL3 яичников окрашивали различные комбинации антител. Рисунок 1А подчеркивает нити терминала и крышка клетки (зеленый), которые в совокупности образуют соматических клеток нишу. Рис 1B, показывает, приобщенных клеток (ИС, пурпурный), которые напрямую связаться половых клеток (синий). <img src="/files/ftp_upload/2537/2537fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. LL3 яичников. (А) моноклональное антитело 1В1 (пурпурный) очертания соматических клеток и пятна fusome, внутриклеточных органелл внутри PGCs (стрелки). Ловушка усилитель чч-LacZ (анти β-галактозидазы, зеленый) выражается в терминале нитей. В основе нити соматических клеток колпачок (стрелки) можно наблюдать. (Б) 1В1 антитело (зеленый) очертания всех соматических клеток в яичнике. Анти-Васа (синий) этикетки всех PGCs. PGCs обратиться непосредственно приобщены клеток (ИС, анти-пробке, пурпурный). Бар (для А и В) составляет 20 мкм.

<ol>
	<li>Fuller, M. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+and+female+Drosophila+germline+stem+cells:+two+versions+of+immortality.">Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality.</a> Science. 316, 402-404 (2007).</li><li>Li, L., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+niche:+structure+and+function.">Stem cell niche: structure and function.</a> Annual review of cell and developmental biology. 21, 605-631 (2005).</li><li>Chen, D., McKearin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+circuitry+controlling+a+stem+cell+niche.">Gene circuitry controlling a stem cell niche.</a> Curr Biol. 15, 179-184 (2005).</li><li>Kai, T., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+empty+Drosophila+stem+cell+niche+reactivates+the+proliferation+of+ectopic+cells.">An empty Drosophila stem cell niche reactivates the proliferation of ectopic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 4633-4638 (2003).</li><li>Kai, T., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+germ+cells+can+revert+into+functional+stem+cells+in+Drosophila+melanogaster+ovaries.">Differentiating germ cells can revert into functional stem cells in Drosophila melanogaster ovaries.</a> Nature. 428, 564-569 (2004).</li><li>Lopez-Onieva, L., Fernandez-Minan, A., Gonzalez-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jak/Stat+signalling+in+niche+support+cells+regulates+dpp+transcription+to+control+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+ovary.">Jak/Stat signalling in niche support cells regulates dpp transcription to control germline stem cell maintenance in the Drosophila ovary.</a> Development. 135, 533-540 (2008).</li><li>Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+anchored+by+adherens+junctions+in+the+Drosophila+ovary+niches.">Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches.</a> Science. 296, 1855-1857 (2002).</li><li>Tazuke, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+germline-specific+gap+junction+protein+required+for+survival+of+differentiating+early+germ+cells.">A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells.</a> Development. 129, 2529-2539 (2002).</li><li>Xie, T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=decapentaplegic+is+essential+for+the+maintenance+and+division+of+germline+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary.">decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary.</a> Cell. 94, 251-260 (1998).</li><li>Xie, T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+niche+maintaining+germ+line+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary.">A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary.</a> Science. , 290-328 (2000).</li><li>Guo, Z., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glypican+Dally+is+required+in+the+niche+for+the+maintenance+of+germline+stem+cells+and+short-range+BMP+signaling+in+the+Drosophila+ovary.">The glypican Dally is required in the niche for the maintenance of germline stem cells and short-range BMP signaling in the Drosophila ovary.</a> Development. 136, 3627-3635 (2009).</li><li>Wang, X., Harris, R. E., Bayston, L. J., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagens+regulate+BMP+signalling+in+Drosophila.">Type IV collagens regulate BMP signalling in Drosophila.</a> Nature. 455, 72-77 (2008).</li><li>Godt, D., Laski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+rearrangement+and+cell+recruitment+in+Drosophila+ovary+morphogenesis+and+the+requirement+of+bric+a+brac.">Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac.</a> Development. 121, 173-187 (1995).</li><li>Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovary+morphogenesis:+analysis+of+terminal+filament+formation+and+identification+of+a+gene+required+for+this+process.">Drosophila ovary morphogenesis: analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process.</a> Developmental biology. 170, 127-135 (1995).</li><li>Song, X., Call, G. B., Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+germline+stem+cell+niche+formation+in+the+Drosophila+ovary.">Notch signaling controls germline stem cell niche formation in the Drosophila ovary.</a> 134, 1071-1080 (2007).</li><li>Zhu, C. H., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+of+ovarian+germline+stem+cells+during+niche+formation+in+Drosophila.">Clonal expansion of ovarian germline stem cells during niche formation in Drosophila.</a> Development. 130, 2579-2588 (2003).</li><li>Ward, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+signal+to+the+niche+through+the+Notch+pathway+in+the+Drosophila+ovary.">Stem cells signal to the niche through the Notch pathway in the Drosophila ovary.</a> Curr Biol. 16, 2352-2358 (2006).</li><li>Gilboa, L., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+primordial+germ+cell+differentiation+parallels+germ+line+stem+cell+maintenance.">Repression of primordial germ cell differentiation parallels germ line stem cell maintenance.</a> Curr Biol. 14, 981-986 (2004).</li><li>Gilboa, L., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soma-germline+interactions+coordinate+homeostasis+and+growth+in+the+Drosophila+gonad.">Soma-germline interactions coordinate homeostasis and growth in the Drosophila gonad.</a> Nature. 443, 97-100 (2006).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Это видео демонстрирует изоляции и окраске протокол конце третьего возраста яичники личиночной. Для выполнения этого протокола в плановом порядке и надежно, следует обратить внимание на следующие моменты: <ol><li> Для синхронизации и хорошо развитые личинки, за скученности следует изб...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J.T.Baker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kcl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J.T.Baker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin Bovine Fraction V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>160069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont biology tweezers 5 dumstar polished</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FST Fine Science Tools</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nickel plated pin holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FST Fine Science Tools</td>
<td>26018-17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FST Fine Science Tools</td>
<td>26002-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CORNING</td>
<td>7220-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6 well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Costar</td>
<td>3516</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel Glaser GmbH</td>
<td>798</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940-223</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vectashield</td>
<td>H-1200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>FAL352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1B1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Traffic Jam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Laboratory of Dr. Dorothea Godt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Vasa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Laboratory of Dr. Ruth Lehmann</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti &beta;-Galactosidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cappel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Secondary Antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection and staining of drosophila larval ovaries

Многие органы зависят от стволовых клеток для их развития в период эмбриогенеза и для технического обслуживания или ремонта в течение взрослой жизни. Понимание того, как стволовые клетки образуются, и как они взаимодействуют с окружающей их средой Поэтому крайне важно для понимания развития, гомеостаза и болезни. Яичник плодовой мушки дрозофилы служил влиятельной моделью для взаимодействия зародышевой линии стволовых клеток (GSCs) с их соматических клетках поддержки (ниши) 1, 2. Известно расположение нишу и GSCs, в сочетании со способностью к генетически манипулировать ими, позволило исследователям выяснить различных взаимодействий между стволовыми клетками и их ниши 3-12. Несмотря на огромное количество информации о механизмах управления GSC обслуживания и дифференциацию, относительно мало известно о том, как GSCs и их соматической форме ниши в процессе разработки. Около 18 соматических ниши, которых клеточные компоненты включают нити терминала и крышка клетки (рис. 1), форму в течение третьего личиночного возраста 13-17. GSCs происходят из первичных половых клеток (PGCs). PGCs размножаться на ранних личиночных стадиях, но после образования нишу подгруппе PGCs становится GSCs 7, 16, 18, ​​19. Вместе нишу соматических клеток и GSCs сделать функциональный блок, который производит яйца в течение всей жизни организма. Многие вопросы, касающиеся образования GSC единицы остаются без ответа. Такие процессы, как координация между клеток-предшественников для ниш и прекурсоров стволовых клеток, или поколение асимметрии в PGCs, поскольку они становятся GSCs, наилучшим образом может быть изучен в личинку. Тем не менее, методические исследования личиночного развития яичников физически сложно. Во-первых, личиночной яичников малы. Даже в конце личиночной стадии они только 100 мкм в диаметре. Кроме того, яичники являются прозрачными и встроены в белый жир тела. Здесь мы опишем шаг за шагом протокол для выделения яичниками с конца третьего возраста (LL3) Drosophila личинки, после окрашивания с флуоресцентными антителами. Мы предлагаем некоторые технические решения проблем, таких как размещение яичников, окрашивания и стирки тканей, которые не тонут, и убедившись, что антитела проникают в ткани. Этот протокол может быть применен к ранее личиночной стадии и личиночной яички, а также.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries at JoVE.com

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Как ниши и стволовые клетки образуются во время развития является важным вопросом практические последствия. В<em&gt; Drosophila</em&gt; Яичников, зародышевой линии стволовых клеток и их соматического ниши форме в течение личиночного развития. Это видео демонстрирует, как до расчленения, пятна и смонтировать женщин гонады с конца третьего возраста (LL3)<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинок.

Разбор и Окрашивание Drosophila Личинок Яичники

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

dissection-and-staining-of-drosophila-larval-ovaries

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

26.0K Views.  Weizmann Institute of Science. Как ниши и стволовые клетки образуются во время развития является важным вопросом практические последствия. В Drosophila Яичников, зародышевой линии стволовых клеток и их соматического ниши форме в течение личиночного развития. Это видео демонстрирует, к...

Video: Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection of Drosophila Ovaries

Препарирование дрозофилы Яичники

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Препарирование личинок ЦНС у дрозофилы

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Дрозофилы личинок NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Дрозофилы личинок NMJ Immunohistochemistry

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Живая Препарирование Drosophila Эмбрионы: Упрощенная методы скрининга Мутант Коллекции антител Окрашивание

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Сердце Dissection в личинок, несовершеннолетних и взрослых данио рерио, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Озвучивание при содействии Иммунофлуоресцентное Окрашивание поздней стадии эмбрионального и личиночного<em&gt; Drosophila</em&gt; Ткани<em&gt; На месте</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Вскрытие и Иммуноокрашивание имагинальные диски из<em&gt; Дрозофилы</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Вскрытие и Монтаж<em&gt; Drosophila</em&gt; Куколочные глаз Диски

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Измерение личинок деятельности в<em&gt; Drosophila</em&gt; Монитор активности

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...