IM wird durch die Marie Curie Reintegration zu gewähren unterstützt. Diese Arbeit wurde von der Israel Science Fund Stipendium nicht unterstützt. 1146-1108, von der Helen und Martin Kimmel Institut für Stammzellforschung am Weizmann Institute of Science und der Leir Charitable Foundation.

1. Eiablage <ol><li> Fünf Tage vor ihrer Zerlegung: allow begatteten Weibchen die Eier für 2-4 Stunden auf frische Lebensmittel mit Hefe ergänzt legen. Um synchronisiert und gut entwickelte Larven, ist es wichtig, nicht zu überfüllt sind kultiviert (ca. 30 Eier / 25mm Durchstechflasche). Typischerweise werden 7-16 Weibchen pro Fläschchen verwendet, je nachdem, wie gut sie lag. </li></ol> 2. Die Auswahl Larven <ol><li> Bereiten Sie eine 9-sowie Glas Sezieren Schale mit Ringer-Medium (128mm NaCl, 2 mM KCl, 1,8 CaCl 2, 4 mm MgCl 2, 35,5 mm Saccharose, 5 mM Hepes pH 6,9) gefüllt. </li><li> Bereiten Zelle Siebe in einem Sechs-Well-Platte mit Ringer-Medium und stellen Sie ihn auf Eis. Alternativ verwenden wir speziell angefertigte Formen mit einer Nylon-Mesh ausgestattet. </li><li> Pick-timed Larven von Fläschchen Wände mit feinen biologischen Pinzetten (Pinzette) und legen Sie sie in die Ringer-mit Sezieren Gericht. </li><li> Übertragen einer weiblichen Larve, um eine saubere gut. Wir unterscheiden Weibchen von Männchen durch ihre Keimdrüsen. Männliche Hoden sind einfach so groß klar Ovale in das hintere Drittel des Fettes eingebettet identifiziert. Weiblichen Eierstöcken, gleichzeitig ein Teil des Fettes Körpers befindet, kann als eine viel kleinere, klar, rund Sphären identifiziert werden. </li></ol> 3. Dissection der Larve <ol><li> Halten Sie die Larve sich unmittelbar hinter dem Gehirn mit einer Pinzette und entfernen Sie den Kopf mit einer zweiten Pinzette. </li><li> Die restlichen hinteren Teil auf der Rückenseite, mit der Luftröhre nach unten. </li><li> Halten Sie die Larve durch die hinteren Luftlöcher mit einer Pinzette und schieben Sie ihn nach innen langsam, während das andere Paar gleitet die Nagelhaut hinten, bis etwa die Hälfte der Larven fetten Körper entsteht. </li><li> Halten Sie das hintere Ende und mit der anderen Pinzette zu locker halten die Schuppenschicht. Langsam und vorsichtig wegziehen hinteren Ende, so dass die Kutikula und der beigefügten Darm schieben durch den Spalt. Am Ende dieses Prozesses sollten die fetten Körper vollständig aus dem Darm und die Kutikula getrennt werden. Trennen Sie den Darm aus dem vorderen Teil der fetten Körper. Um Fleckenbildung und Montage zu erleichtern, ist es wichtig, dass die fetten Körper intakt bleibt. </li><li> Wet einer Weide Pipette gründlich mit Ringer-Medium, vorzugsweise aus einem Brunnen mit seziert Larven. Dies hilft Mantel der Pipette und verhindert, dass die fetten Körper hängen bleibt. Verwenden Sie die Weide Pipette auf die fetten Körper in die eiskalte Ringerlösung Medium in die Zelle Sieb übertragen. </li></ol> 4. Fixierung und Färbung Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, mit Ausnahme der Inkubation mit dem ersten Antikörper, bei 4 ° C. <ol><li> Inkubieren Sie die fetten Körper in 5% Formaldehyd in Ringer-Medium. für 20 Minuten unter leichtem Schütteln. </li><li> Wash für 5 Minuten mit 1% PBT (1% Triton x-100 in PBS). Wiederholen Sie diesen Schritt für 10 Minuten und ein drittes Mal für 45 Minuten. 1% Triton X-100 ist erforderlich, um die Larven Eierstock perforieren und damit ausreichend Antikörper gegen sie zu durchdringen. </li><li> Block mit 0,3% PBTB (0,3% Triton x-100 und 1% BSA in PBS) für 1 Stunde unter leichtem Schütteln </li><li> Inkubieren mit dem gewünschten 1 st Antikörper in 0,3% PBTB über Nacht bei 4 ° C verdünnt unter leichtem Schütteln. Dieser Schritt ist in der Regel in 0,2 ml Röhrchen auf einem Rollenprüfstand durchgeführt. </li><li> Transfer fetten Körper zurück zu Zelle Siebe. </li><li> 3 x waschen, jeweils 30 Minuten, mit 0,3% PBTB unter leichtem Schütteln. </li><li> Block mit 0,3% PBTB mit 5% normalem Esel-Serum für 1 Stunde unter leichtem Schütteln ergänzt. </li><li> Inkubieren mit einem geeigneten sekundären Antikörper verdünnt (nach Herstellerangaben) in Blocking-Lösung (0,3% PBTB mit 5% normalem Esel-Serum in 0,3% PBT ergänzt) für 2 Stunden unter leichtem Schütteln. Wenn der Antikörper ist fluoreszierend, in der Dunkelheit ab diesem Zeitpunkt zu inkubieren. Dieser Schritt ist in der Regel in 0,2 ml Röhrchen auf einem Rollenprüfstand durchgeführt. </li><li> Wash 3 mal für jeweils 30 Minuten mit 0,3% PBT unter leichtem Schütteln. </li></ol> 5. Montage <ol><li> Übertragen Sie die fetten Körper, um eine saubere Eppendorf-Röhrchen. Sehr vorsichtig alle Flüssigkeiten entfernt und sofort mit Vectashield Montage Medien abdecken. Wir verwenden Vectashield routinemäßig, da sie nicht verhärten, während die Eierstöcke aus dem fetten Körper getrennt sind. Die Proben können bei der Montage Medien bei 4 ° C gelagert werden bis zu einer Woche. </li><li> Schneiden Sie das Ende einer Pipettenspitze und verwenden Sie es sorgfältig zu überweisen Sie den fetten Körper mit minimalem Volumen von Montage-Medien (etwa 30 ul für einen 30mm Deckglas) auf einen Objektträger. </li><li> Verwenden Sie zwei vernickelten Pin-Halter, hält 0,1 mm Durchmesser Stifte, um sich auszubreiten die fetten Körper. Die Eierstöcke sind an der hinteren Drittel der fetten Körper entfernt. Die fetten Körper, die sie umgibt, ist in der Regel wie eine &quot;Blume&quot; geprägt. Dies hilft bei der Identifizierung der Lage der Eierstöcke. Sezieren die &quot;Blumen&quot; aus dem Rest der fetten Körper und entsorgen Sie diese. </li><li> Entfernen Sie die fetten Körper Surrounding der Gonade durch Kreuzung der beiden Stifte vorsichtig um ihn herum. Legen Sie die isoliert Gonade auf der Folie von der fetten Körper Rückstand. </li><li> Abdeckung mit einem Deckglas und Dichtung mit Nagellack. </li><li> Visualisieren Sie direkt mit einem konfokalen Mikroskop. Die Proben können bei 4 ° C gelagert werden bis zu drei Wochen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Wir haben die oben genannten Protokoll verwendet, um die Einrichtung mehrerer Zelllinien im Rahmen der somatischen Eierstock, darunter GSCS und ihre somatischen Nischen folgen. Zu diesem Zweck verwenden wir spezifische Antikörper und Marker, um zwischen den verschiedenen Zelltypen in den Entwicklungsländern Gonade zu unterscheiden. Hier zeigen wir ein Beispiel von zwei LL3 Eierstöcke mit verschiedenen Kombinationen von Antikörpern gefärbt. Abbildung 1A Highlights Terminal Filament-und cap-Zellen (grün), die zusammen die somatischen Zellen der Nische. Abbildung 1B zeigt die vermischten Zellen (ICs, magenta), die direkt an Keimzellen (blau). <img src="/files/ftp_upload/2537/2537fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. LL3 Eierstöcke. (A) monoklonale Antikörper 1B1 (magenta) skizziert somatischen Zellen und färbt die fusome, einem intrazellulären Organellen innerhalb PGCs (Pfeile). Die Enhancer-trap hh-lacZ (anti β-Galactosidase, Grün) befindet sich im Terminal Filamente ausgedrückt. An der Basis des Filaments somatischen Zellen Kappe (Pfeilspitzen) beobachtet werden können. (B) 1B1-Antikörper (grün) beschreibt alle somatischen Zellen in den Eierstöcken. Anti-Vasa (blau) Etiketten aller PGCs. PGCs direkt an den vermischten Zellen (ICs, Anti-Stau, magenta). Bar (für A und B) ist 20 um.

<ol>
	<li>Fuller, M. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+and+female+Drosophila+germline+stem+cells:+two+versions+of+immortality.">Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality.</a> Science. 316, 402-404 (2007).</li><li>Li, L., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+niche:+structure+and+function.">Stem cell niche: structure and function.</a> Annual review of cell and developmental biology. 21, 605-631 (2005).</li><li>Chen, D., McKearin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+circuitry+controlling+a+stem+cell+niche.">Gene circuitry controlling a stem cell niche.</a> Curr Biol. 15, 179-184 (2005).</li><li>Kai, T., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+empty+Drosophila+stem+cell+niche+reactivates+the+proliferation+of+ectopic+cells.">An empty Drosophila stem cell niche reactivates the proliferation of ectopic cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 4633-4638 (2003).</li><li>Kai, T., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiating+germ+cells+can+revert+into+functional+stem+cells+in+Drosophila+melanogaster+ovaries.">Differentiating germ cells can revert into functional stem cells in Drosophila melanogaster ovaries.</a> Nature. 428, 564-569 (2004).</li><li>Lopez-Onieva, L., Fernandez-Minan, A., Gonzalez-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jak/Stat+signalling+in+niche+support+cells+regulates+dpp+transcription+to+control+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+ovary.">Jak/Stat signalling in niche support cells regulates dpp transcription to control germline stem cell maintenance in the Drosophila ovary.</a> Development. 135, 533-540 (2008).</li><li>Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+anchored+by+adherens+junctions+in+the+Drosophila+ovary+niches.">Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches.</a> Science. 296, 1855-1857 (2002).</li><li>Tazuke, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+germline-specific+gap+junction+protein+required+for+survival+of+differentiating+early+germ+cells.">A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells.</a> Development. 129, 2529-2539 (2002).</li><li>Xie, T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=decapentaplegic+is+essential+for+the+maintenance+and+division+of+germline+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary.">decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary.</a> Cell. 94, 251-260 (1998).</li><li>Xie, T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+niche+maintaining+germ+line+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary.">A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary.</a> Science. , 290-328 (2000).</li><li>Guo, Z., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glypican+Dally+is+required+in+the+niche+for+the+maintenance+of+germline+stem+cells+and+short-range+BMP+signaling+in+the+Drosophila+ovary.">The glypican Dally is required in the niche for the maintenance of germline stem cells and short-range BMP signaling in the Drosophila ovary.</a> Development. 136, 3627-3635 (2009).</li><li>Wang, X., Harris, R. E., Bayston, L. J., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagens+regulate+BMP+signalling+in+Drosophila.">Type IV collagens regulate BMP signalling in Drosophila.</a> Nature. 455, 72-77 (2008).</li><li>Godt, D., Laski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+rearrangement+and+cell+recruitment+in+Drosophila+ovary+morphogenesis+and+the+requirement+of+bric+a+brac.">Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac.</a> Development. 121, 173-187 (1995).</li><li>Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovary+morphogenesis:+analysis+of+terminal+filament+formation+and+identification+of+a+gene+required+for+this+process.">Drosophila ovary morphogenesis: analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process.</a> Developmental biology. 170, 127-135 (1995).</li><li>Song, X., Call, G. B., Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+germline+stem+cell+niche+formation+in+the+Drosophila+ovary.">Notch signaling controls germline stem cell niche formation in the Drosophila ovary.</a> 134, 1071-1080 (2007).</li><li>Zhu, C. H., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+of+ovarian+germline+stem+cells+during+niche+formation+in+Drosophila.">Clonal expansion of ovarian germline stem cells during niche formation in Drosophila.</a> Development. 130, 2579-2588 (2003).</li><li>Ward, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+signal+to+the+niche+through+the+Notch+pathway+in+the+Drosophila+ovary.">Stem cells signal to the niche through the Notch pathway in the Drosophila ovary.</a> Curr Biol. 16, 2352-2358 (2006).</li><li>Gilboa, L., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+primordial+germ+cell+differentiation+parallels+germ+line+stem+cell+maintenance.">Repression of primordial germ cell differentiation parallels germ line stem cell maintenance.</a> Curr Biol. 14, 981-986 (2004).</li><li>Gilboa, L., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soma-germline+interactions+coordinate+homeostasis+and+growth+in+the+Drosophila+gonad.">Soma-germline interactions coordinate homeostasis and growth in the Drosophila gonad.</a> Nature. 443, 97-100 (2006).</li></ol>

Dieses Video zeigt eine Isolation und Färbeprotokoll des späten dritten Larvenstadium Larven Eierstöcke. Um dieses Protokoll regelmäßig und zuverlässig, sollten ihr Augenmerk auf die folgenden Punkte beachtet werden: <ol><li> Für synchronisiert und gut entwickelte Larven, muss über Verdrängung vermieden werden. </li><li> Zur Vermeidung von Verlust der kleine, durchsichtige Eierstöcke, stellen Sie sicher, sezieren die fetten Körper intakt. Dies wird auch bei der Lokalisierung der Eierstöcke bei der Montag...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J.T.Baker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kcl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J.T.Baker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin Bovine Fraction V</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>160069</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont biology tweezers 5 dumstar polished</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FST Fine Science Tools</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nickel plated pin holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FST Fine Science Tools</td>
<td>26018-17</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FST Fine Science Tools</td>
<td>26002-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CORNING</td>
<td>7220-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6 well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Costar</td>
<td>3516</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel Glaser GmbH</td>
<td>798</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940-223</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mounting media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vectashield</td>
<td>H-1200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>FAL352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1B1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Traffic Jam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Laboratory of Dr. Dorothea Godt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Vasa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Laboratory of Dr. Ruth Lehmann</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti &beta;-Galactosidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cappel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Secondary Antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection and staining of drosophila larval ovaries

Viele Organe sind abhängig von Stammzellen für ihre Entwicklung während der Embryogenese und zur Wartung oder Reparatur im Erwachsenenalter. Zu verstehen, wie Stammzellen zu bilden, und wie sie mit ihrer Umwelt interagieren, ist daher von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Entwicklung, Homöostase und Krankheit. Der Eierstock der Fruchtfliege Drosophila melanogaster als ein einflussreiches Modell für das Zusammenwirken von Keimbahn-Stammzellen (GSCS) mit ihren somatischen Stützzellen (Nischen-) 1, 2 serviert. Die bekannte Position der Nische und die GSCS, gekoppelt mit der Fähigkeit, genetisch zu manipulieren, ist Forschern erlaubt, eine Vielzahl von Wechselwirkungen zwischen Stammzellen und ihren Nischen 3-12 aufzuklären. Trotz der Fülle von Informationen über Mechanismen, die GSC Wartung und Differenzierung, ist relativ wenig darüber, wie GSCS und ihre somatischen Nischen bilden während der Entwicklung bekannt. Etwa 18 somatische Nischen, deren zelluläre Komponenten umfassen Terminal Filament-und cap-Zellen (Abbildung 1) bilden im dritten Larvenstadium 13-17. GSCS stammen aus primordialen Keimzellen (PGC). PGCs wuchern in den frühen Larvenstadien, aber nach der Bildung der Nische eine Untergruppe von PGCs wird GSCS 7, 16, 18, ​​19. Zusammen bilden die somatischen Zellen Nische und die GSCS eine funktionelle Einheit, die Eier produziert während der gesamten Lebensdauer des Organismus. Viele Fragen bezüglich der Bildung der GSC-Einheit bleiben unbeantwortet. Prozesse wie die Koordinierung zwischen Vorläuferzellen für Nischen und Stammzell-Vorstufen, oder die Erzeugung der Asymmetrie innerhalb PGCs, wie sie GSCS werden, lässt sich am besten in der Larve untersucht werden. Allerdings ist eine methodische Untersuchung der Larven Eierstock Entwicklung körperlich anspruchsvoll. Erstens sind Larven Eierstöcke klein. Selbst am späten Larvenstadien sind sie nur 100 um across. Darüber hinaus werden die Eierstöcke transparent und werden in einem weißen Fett eingebettet. Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung von Eierstöcken von späten dritten Larvenstadium (LL3) Drosophila-Larven, durch Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern. Wir bieten einige technische Lösungen für Probleme wie das Auffinden der Eierstöcke, Färbung und Waschen Gewebe, die nicht untergehen, und sicherzustellen, dass Antikörper in das Gewebe eindringen. Dieses Protokoll kann zu früheren Larvenstadien und Larven Hoden als auch angewandt werden.

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Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Wie Nischen und Stammzellen während der Entwicklung bilden eine wichtige Frage mit praktischen Auswirkungen. Im<em&gt; Drosophila</em&gt; Eierstock Keimbahn-Stammzellen und ihre somatischen Nischen bilden sich während Larvalentwicklung. Dieses Video zeigt, wie zu sezieren, Flecken und montieren weiblichen Keimdrüsen von späten dritten Larvenstadium (LL3)<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven.

Dissection und Färbung von Drosophila Larven Ovarien

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

dissection-and-staining-of-drosophila-larval-ovaries

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

26.1K Aufrufe.  Weizmann Institute of Science. Wie Nischen und Stammzellen während der Entwicklung bilden eine wichtige Frage mit praktischen Auswirkungen. Im Drosophila Eierstock Keimbahn-Stammzellen und ihre somatischen Nischen bilden sich während Larvalentwicklung. Dieses Video zeigt, wie zu sezieren, Flecken und montieren weiblichen Keimdrüsen von späten dritten Larvenstadium (LL3) Drosophila Larven.

Serie: Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection of Drosophila Ovaries

Dissection von Drosophila Ovarien

Forschung

Biologie

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection der Larven ZNS von Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila Larven NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Live-Präparation Drosophila Embryos: Optimierte Verfahren für das Screening Mutant Sammlungen von Antikörper-Färbung

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Herz Dissection in Larven, juvenile und adulte Zebrafisch, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Dissection und Montage<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Die Messung der Aktivität in der Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...