Мы хотели бы поблагодарить Дональда Ready и Кевин Моисею для обучения JPK оригинальный имагинальную процедуру диск рассечение. Мы также благодарим Бонни Weasner для половых диска в рисунке 1b и глаз диска в рисунке 2А, Брэндон Weasner для рисунке 3, Блумингтон дрозофилы со Центр лету пятен и Развивающие Исследования Hybridoma банк антител. CMS была поддержана стипендией от Национальных институтов здравоохранения (NIH) GCMS подготовки Гранта (T32-GM007757), Фрэнк У. Патнэм исследовательский грант, и исследовательский грант Роберт Бриггс. JPK поддерживается грантом Национального института глаза (R01 EY014863)

1 Подготовка личинок <ol><li> Заполните 35 мм чашки Петри с рассечение буфера. </li><li> Поместите личинок в чашку Петри и дать им возможность плавать вокруг в течение нескольких минут (самоочищающиеся шаг). </li><li> Трансфер личинок в пул рассечение буфера на основе силикона вскрытии пластины. Этот пул должна быть на одном краю пластины. Рассечение пластина состоит из силиконового раствора, который был наливают и закаленной в стеклянную чашку Петри. </li><li> Использование Пастера-пипетки, разместить большее объединение рассечение буфера в середине вскрытии пластины. </li><li> Использование # 5 щипцы, передачи одного очищенный личинку из небольшого бассейна на более широкий круг рассечение буфера. </li></ol> 2 Грубый Рассечение личинок <ol><li> В то время как личинка все еще находится в большой луже рассечение буфера обхватить личинку с пинцетом. Одна пара щипцов следует использовать, чтобы захватить рот крючки в то время как другая пара щипцов используется для хранения Анималь-прежнему (захватить личинку осторожно в 1/3 длины тела). </li><li> Держите стабилизировать пару щипцов, содержащих кутикулу вблизи устья крючков в то время как быстро потянув остальную часть тела прочь с второй парой щипцов. </li><li> Когда личинка начинает рвать на части вы почувствуете легкое освобождение напряженности. Отпустите личинку от щипцов и позволяют &quot;внутренности&quot; личинки выливаться. Это позволяет имагинальных дисков, чтобы оставаться в своей нормальной конформации и предотвращает их от деформации. </li><li> С одной парой щипцов понять рот крючки снова, чтобы удерживать передний конец личинки на месте. Использование другой парой щипцов удалить ниже 2/3 личинок в том числе внутренних кишки. Примечание: комплекс, содержащий рот крючки, глаз-усиков диски, полушарий мозга, вентральной ганглиозных, слюнных желез, некоторые диски ног, и перекрывающие кутикула останется. </li><li> С парой щипцов осторожно удалите облегающего кутикулу, слюнных желез, диски ног идругой ткани. Примечание: только ткани, которая должна остаться в рот крючки, глазные-усиков диски, полусферы мозга и вентральный нервный узел (рисунок 3). </li><li> Повторите шаги 2.1-2.5 с дополнительной личинок в течение 15-20 мин. Примечание: имагинальные диски, которые остаются в рассечение буфера в течение более длительных периодов времени, как правило, ухудшает и в конечном счете будет выглядеть как далеко не идеальных образцов, которые будут фотографировать. Таким образом, после того, как максимум 20 мин все рассеченные ткани должны быть переданы в PLP фиксатора (смотри ниже). </li></ol> 3 Фиксация и окрашивание ткани с антителами <ol><li> Использование Pipetman P-200, передать расчлененные тканей к часовым стеклом, содержащего холодную Параформальдегид-лизин-Периодатное (ПЛП) фиксатором. Ограничение объем переданного буфера рассечение до 50 мкл для минимизации разбавление PLP. Обязательно обрежьте кончик лезвием бритвы так, чтобы отверстие наконечника достаточно большой, чтобы разместить отсеченных тканей. Использование пару щипцов иливольфрамовой иглы убедитесь, что расчлененный ткани полностью погружены для того, чтобы собственно фиксация происходит. Инкубируйте рассеченные ткани в холодной PLP фиксатором в течение 45 мин. Это инкубирование может происходить при комнатной температуре без перемешивания. </li><li> Использование Pipetman P-200, передать расчлененные ткани мыть буфер (RT) с помощью другого сократить желтый наконечник в течение 45 мин. Ограничение объем передаваемой PLP до 50 мкл для минимизации разбавление промывочного буфера. Примечание: все расчлененные ткани должны быть полностью погружены. </li><li> Трансфер 20-30 комплектов расчлененный ткани до 1,5 мл пробирке. Примечание: если большее число глазных-усиков комплексов диска объединены внутри трубки, существует возможность того, что ткани в нижней части трубки не будут подвергаться образом с антителами. Для получения оптимальных результатов не более 20-30 глаз-усиков комплексы дисковые не должны присутствовать в одной пробирке. Рассеченные ткани будет оседать на дне пробирке. Поэтому в последующие этапы UС.Е. Pipetman удалить и заменить промывочного буфера, блокирующий решение, и антитела. </li><li> Удалить промывочного буфера и заменить 100 мкл блокирующего раствора: 10% нормальной козьей сывороткой в ​​промывочного буфера. Выдержите при комнатной температуре с легким вращением на столе ротатора в течение 10 мин. </li><li> Удалить блокирующий решение и заменить 100 мкл первичных антител, которые соответствующим образом разведенных в 10% нормальной козьей сывороткой. Инкубируют при комнатной температуре при осторожном вращении в течение 16 часов. </li><li> Удалить первичных антител и заменить 750 мкл промывочного буфера. Поместите трубки на nutator и позволяют nutate при комнатной температуре в течение 10 мин. Примечание: первичное антитело может быть сохранен (хранить при 4 ° С) и повторно позже. Повторное использование антител одного раза может помочь в снижении неспецифического связывания. </li><li> Разрешить головки оседают на дне пробирки, а затем удалить промывочного буфера и добавить 100 мкл вторичных антител, которые соответствующим образом разбавленного в 10% нормальной сывороткой. Выдержите при комнатной температуре с легким вращением для 2̵1; 4 ч. </li><li> Удалить решений вторичное антитело из ткани и замены с 500 мкл промывочного буфера. Разрешить ткани оседают на дне пробирки. </li><li> Использование P-200 и вырезать желтый наконечник, передать все расчлененные тканей в луже промывочного буфера, который был размещен на вскрытии блюдо. В то время как приступить к следующему шагу изобразительного вскрытия, ткань будет инкубировать в промывочного буфера. Это помогает удалить избыток вторичного антитела. </li></ol> 4 Изысканные Рассечение Eye-усиков Disc комплексов и Монтаж на слайдах <ol><li> Используйте одну пару щипцов обхватить кутикулу устами крючков с вентральной стороне комплекса вниз. Со вторым пинцета удалите из двух долей мозга, закрыв вторую щипцов в пространстве между головного мозга и глаз дисков (рисунок 3, красная стрелка) и стремительно тянет мозг от устья крючков. </li><li> Продолжая удерживать на рот крючки, отщипнутьткань как можно ближе к связи между усиков части глаз-усиков диска и рта крючков (рис 3, синяя стрелка). Примечание: глазные-усиков комплексы дисковые должны быть свободны от всех тканей (рисунок 1А). Продолжайте, пока все желаемый ткани желательно, чтобы можно поместить на слайды не была расчленена. Этот протокол может быть адаптирован, чтобы изолировать крыло, haltere, ноги и генитальные имагинальные диски (рис 1B-E). </li><li> Добавьте две небольшие кусочки папиросной бумаги (ширина покровные) около 3 в. Друг от друга на вскрытии блюдо. Поместите предметное стекло на блюдо - два куска тонкой бумаги должны находиться под концах слайде. Это предотвратит сползание от прилипания к силиконовой основе рассекает блюдо. </li><li> Использование P-20 с неразрезанного наконечником, добавить 9 мкл анти-отбеливающего агента в середине стекло микроскопа. Это предотвращает обесцвечивание ткани, если смотреть с флуоресцентнойсвет. </li><li> Используя тот же режиссерский совет, собрать все глаза-усиков диски и добавьте их в капле анти-отбеливающего реагента. Сведение к минимуму количества промывочного буфера, который осуществляется более. Попытка ограничить объем промывочного буфера 10 мкл или менее. </li><li> Используйте пару щипцов для разделения и распростерла глаз-усиков дисков в капле анти-отбеливающего реагента. Разрешить диски для инкубации в анти-отбеливающего реагента в течение нескольких минут. Примечание: диски получится ясно, как ткань поглощает анти-отбеливающий реагент. </li><li> Использование тонкой кистью аккуратно опустите покровное на образец. Это предотвращает образование воздушных пузырьков. </li><li> Магазин скользит при -20 ° С до готовности для просмотра глаза усиков или другие имагинальные диски, используя свет или флуоресцентной микроскопии. </li></ol>

<ol>
	<li>Weismann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+nachembryonale+entwicklung+der+Musciden+nach+beobachtungen+an+Musca+vomitoria+und+Sarcophaga+carnaria.">Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria.</a> Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 .</li><li>Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaginal disc development. , 747-841 (1993).</li><li>Held, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+Discs:+The+Genetic+and+Cellular+Logic+of+Pattern+Formation.">Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation.</a> Developmental and Cell Biology Series. 39, 460 (2002).</li><li>Miall, L. C., Hammond, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+head+of+the+imago+of+Chironomus.">The development of the head of the imago of Chironomus.</a> Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 .</li><li>Kellog, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+homologies+of+the+mouth+parts+of+insects.">The development and homologies of the mouth parts of insects.</a> Am. Nat. 36, 683-706 (1902).</li><li>Eassa, Y. E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+imaginal+buds+in+the+head+of+Pieris+brassicae+Linn.+(Lepidoptera).">The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera).</a> Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).</li><li>Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage,+growth,+and+determination+in+the+imaginal+leg+discs+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 20, 263-290 (1969).</li><li>Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+analysis+of+development+in+Drosophila+melanogaster:+morphogenesis,+determination+and+growth+in+the+wild+type+antenna.">A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna.</a> Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).</li><li>Anderson, D. T., Counce, S., Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+hemimetabolous+insects.">The development of hemimetabolous insects.</a> Developmental Systems. , 165-242 (1972).</li><li>Anderson, D. T., Counce, S., Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+hemimetabolous+insects.">The development of hemimetabolous insects.</a> Developmental Systems. , 96-163 (1972).</li><li>Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+polyclones+in+insect+development.">Compartments and polyclones in insect development.</a> Science. 189, 340-347 (1975).</li><li>Wieschaus, E., Gehring, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+primordial+disc+cells+in+the+early+embryo+of+Drosophila+melanogaster.">Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).</li><li>Lawrence, P. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+development+of+mesothoracic+compartments+in+Drosophila.+An+analysis+of+cell+lineage+and+fate+mapping+and+an+assessment+of+methods.">The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods.</a> Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).</li><li>Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster.">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+determination+the+beginning+of+eye+development.">Retinal determination the beginning of eye development.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=My+what+big+eyes+you+have:+how+the+Drosophila+retina+grows.">My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows.</a> Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li><li>Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+loci+required+for+follicular+patterning+using+directed+mosaics.">Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics.</a> Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+mushroom+body+is+a+quadruple+structure+of+clonal+units+each+of+which+contains+a+virtually+identical+set+of+neurones+and+glial+cells.">The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells.</a> Development. 124 (4), 761-771 (1997).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li><li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye:+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave.">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li><li>Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TGF+beta+homolog+dpp+and+the+segment+polarity+gene+hedgehog+are+required+for+propagation+of+a+morphogenetic+wave+in+the+Drosophila+retina.">The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina.</a> Cell. 75, 913-926 (1993).</li><li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+segment+polarity+gene+hedgehog+is+required+for+progression+of+the+morphogenetic+furrow+in+the+developing+Drosophila+eye.">The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye.</a> Cell. 75, 927-938 (1993).</li><li>Heberlein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+in+the+Drosophila+eye+coordinated+by+hedgehog.">Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog.</a> Nature. 373, 709-711 (1995).</li><li>Dominguez, M., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+directly+controls+initiation+and+propagation+of+retinal+differentiation+in+the+Drosophila+eye.">Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye.</a> Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).</li><li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Drosophila+eye+development+by+Decapentaplegic.">Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li><li>Borod, E. R., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+regulation+of+decapentaplegic+and+hedgehog+during+the+initiation+of+differentiation+in+the+Drosophila+retina.">Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina.</a> Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).</li><li>Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern-specific+expression+of+the+Drosophila+decapentaplegic+gene+in+imaginal+disks+is+regulated+by+3'+cis-regulatory+elements.">Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements.</a> Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).</li><li>Blackman, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+3'+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic,+a+member+of+the+TGF-b+family+in+Drosophila.">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila.</a> Development. 111, 657-665 (1991).</li><li>Campos, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+the+locus+elav+in+Drosophila+melanogaster:+a+gene+whose+embryonic+expression+is+neural+specific.">Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific.</a> Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).</li><li>Robinow, S., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+locus+elav+of+Drosophila+melanogaster+is+expressed+in+neurons+at+all+developmental+stages.">The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages.</a> Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time.">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).</li><li>Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeo+domain+protein+rough+is+expressed+in+a+subset+of+cells+in+the+developing+Drosophila+eye+where+it+can+specify+photoreceptor+cell+subtype.">The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype.</a> Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).</li><li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atonal,+rough+and+the+resolution+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina.">Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).</li><li>Kumar, J. P., Moses, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+Receptor+and+Notch+signaling+act+upstream+of+Eyeless/Pax6+to+control+eye+specification.">EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification.</a> Cell. 104, 687-697 (2001).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Хотя эта процедура в значительной степени сосредоточены на изоляции и последующего лечения глазных-усиков дисков, она поддается используется выделить и проанализировать крыло, haltere, ногу и генитальные диски (Рисунок 4). Единственным обязательным модификация протокола для выд...

Для более века плодовой мушки, дрозофилы, был главным система для изучения развития, поведение и физиологию. Развитие в лету можно разделить на две большие стадии: эмбриональных и пост-эмбриональных с большей частью последнего, происходящих в монослоя эпителия называемых имагинальные диски 1-3. Чертежи имагинальных дисках были впервые опубликованы в 1864 году Августом Вейсмана в рамках своего широкого монографии о развитии насекомых 1. Эти диски начинают свое развитие во время эмбриогенеза, по образцу в течение личиночной стадии, пережить массовое гистолиза ранних куколки, и в конечном итоге привести к высоким процентом взрослых структур, которые находятся в пределах взрослой мухи 1-14. Во время развития личинок каждый диск делает несколько важных решений относительно судьбы, формы и размера. В первом и втором личиночных возрастов, диски поручено принятия первичный судьбу, establisповесят границы отсека, приняв правильную форму и генерации необходимого количества клеток 15-16. Во время третьего личиночного возраста и ранней стадии предварительного куколки, имагинальные диски продолжают делиться и с рисунком, как клетки принять свои терминальные судьбы 16. В ранней истории Drosophila биологии развития, имагинальные диски были изучены почти исключительно в контексте нормального развития и в ограниченных случаях, когда утрата или усиления из-функции мутант жизнеспособным. Использование рентгеновских лучей, чтобы побудить митотический рекомбинации позволило летальных мутаций, которые будут проанализированы в клеточных клонов в рамках взрослой и личиночной тканей. Этот метод был усовершенствован путем введения трансгенных методов для анализа потерь и получить-из-функции мутации в обеих личинок и взрослых тканей. Количество антитела, транскрипционных репортеров и белка ловушки для описания молекулярной ландшафт дикого типа и мутантных тканей также строительстваantly растет. Используя эти молекулярные маркеры для анализа потерь и получить-из-функции мутант клонов клеток сделало более целесообразным, чтобы получить в режиме реального времени понимание того, как мутантные клетки отклоняются от своих диких родственников типа в процессе разработки. Чтобы правильно воспользоваться этими инструментами и реагентов важно иметь качественные препараты имагинальных дисках, которые можно просматривать, сфотографировали и проанализированы. Цель этой рукописи является обеспечение оптимизированный протокол для выделения и подготовки глаз-усиков диска комплекса (Рисунок 1А). Она также может быть успешно использован для выделения широкий спектр дополнительных дисков, включая те, которые приводят к возникновению крылья, жужжальцам, T1-T3 ног и половых органов (Рисунок 1В-E). Эта процедура, с незначительными изменениями, был использован для изоляции имагинальные диски из Drosophila в течение почти восьмидесяти лет. Как описано выше, так как большинство гены экспрессируются во муltiple стадиях развития и в множестве тканей, часто невозможно, чтобы изучить эффекты, что нулевые мутанты имеют на всей глазом как животное умирает задолго до третьего возраста личиночной стадии. Четыре метода сделали изучение более развитых тканей, таких как сетчатка значительно более сговорчивым. Первым из них является метод Flippase (ФЛП) / Flippase рекомбинация Целевая (FRT) генерировать мутантных клонов клеток в противном случае дикого типа ткани 17-19. В данном случае мутантный ткань идентифицированы по отсутствию визуального маркера, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его можно сравнить с окружающей ткани дикого типа, в которых присутствует GFP (2D) Рис. Второй метод &quot;ар-аут&quot;, в котором трансген экспрессируется в популяции клеток 20. В этом случае клеточные клоны идентифицируются наличием GFP и по сравнению с окружающим дикого типа ткани, которая испытывает недостаток в GFP репортер (Рисунок2E). Третий является анализ Мозаика с репрессируемый сотовый Маркер (MARCM) техники, которая сочетает в себе элементы мутантного клона ФЛП / FRT и ФЛП-из выражений систем 21. С помощью этого метода трансген может быть выражена в популяции клеток, которые одновременно мутанта для индивидуального генетического локуса. Как ФЛП-из клонов, MARCM клоны идентифицируются наличием GFP и по сравнению с окружающим дикого типа ткани, которая испытывает недостаток в GFP маркер (Рисунок 2F). И, наконец, гены и РНК-интерференции конструкции могут быть выражены в имагинальных тканей под контролем конкретных промоутер-GAL4 конструкций. Эти четыре метода увеличили интерес к изучению имагинальные диски с мутантные или Сверхэкспрессия клоны или узоры можно напрямую сравнивать с соседней дикого типа ткани. Метод, описанный в этой процедуре была разработана таким образом, что исследователи, изучающие постэмбрионального развития взрослых тканях у дрозофилы,особенно те, которые получены из глаз-усиков диска, смогут получить качественное ткани для анализа. Хотя отдельные исследователи сделали небольшие изменения, в основе этой процедуры (которые мы опишем здесь) остается практически неизменным. После получения высокого качества ткани имеет решающее значение для изучения имагинальных дисков мы надеемся, что это написано протокол и сопровождающие видео будет служить в качестве ценного учебного ресурса.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="915">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:165px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:360px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Used to create base for dissection plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pryex Glass Petri Dish 150x20mm</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3160-152CO</td>
			<td>Use the cover for dissection plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#5 Dissecting Forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>525</td>
			<td>Forceps must be kept very sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">9 well watch glass</td>
			<td>Vairous Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for fixation of imaginal disc complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Erlenmeyer Flask</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small Stir Bar</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Small enough to fit into Erlenmeyer Flask</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Conical Tubes</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5ml Microfuge Tubes</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clear or Dark depending upon application</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge Rack</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benchtop Rotator</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>100ul volume should not splatter at low setting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Macron Chemicals</td>
			<td>2-26555-1</td>
			<td>Serves as fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>S-3139</td>
			<td>Used to make dissection and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>71636</td>
			<td>Used to make dissection and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125221000</td>
			<td>Used in the fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Periodate</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>S-1878</td>
			<td>Used in the fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MTX1568-1</td>
			<td>Used to perforate imaginal discs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>EM Science</td>
			<td>SX0593-3</td>
			<td>Used to dissolve paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% Normal Goat Serum`</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>Serves as a blocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary Antibodies</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seondary Antibodies</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Prevents bleaching of samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>48312-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Cover Slips 18x18mm</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe Tissue</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>NA</td>
			<td>Prevents Glass slides from adhering to silicone base</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Panit Brush 000</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use to gently lower coverslip on to samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster

Значительная часть пост-эмбрионального развития дрозофилы, дрозофилы, происходит в рамках набора SAC-как структуры, называемые имагинальные диски. Эти диски порождают высокий процент взрослых структур, которые находятся в пределах взрослого лету. Здесь мы опишем протокол, который был оптимизирован для восстановления этих дисков и подготовить их для анализа с антителами, транскрипционных репортеров и белковых ловушек. Эта процедура лучше всего подходит для тонких тканей, таких как имагинальных дисках, но может быть легко модифицирована для использования с более толстыми тканей, таких как личиночной мозга и взрослых яичника. Письменное протокол и сопровождающие видео поможет читателя / зрителя через рассечения третьей возрастной стадии личинок, фиксации ткани и лечения имагинальных дисках с антителами. Протокол может быть использован, чтобы рассекать имагинальные диски от младшего личинок первой и второй возрастной стадии а. Преимущество этого протокола является то, что она является относительно коротким, и он имеет бытьан оптимизирован для сохранения высокого качества из рассеченной ткани. Еще одним преимуществом является то, что процедура фиксации, который используется хорошо работает с подавляющим числом антител, которые распознают Drosophila белки. По нашему опыту, есть очень небольшое количество чувствительных антител, которые не очень хорошо работают с этой процедурой. В таких ситуациях, появится средство, чтобы быть использовать альтернативный коктейль фиксации, продолжая следовать указаниям, которые мы, предъявляемым к шагов рассечение и инкубации антител.

Метод, описанный выше надежно производит высококачественный материал для анализа с в точке зондов, транскрипционных репортеров, белковых ловушек и антител. На рисунке 1 мы показываем глаз-антенны, генитальный, крыло, haltere и ног диски, которые обычно восстановленные с помо?...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster at JoVE.com

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Вскрытие и Иммуноокрашивание имагинальные диски из<em&gt; Дрозофилы</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

26.3K Views.  Indiana University. The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Video: Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Препарирование личинок ЦНС у дрозофилы

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Препарирование имагинальных дисков с 3-го личинки дрозофилы Инстар

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Дрозофилы личинок NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Живая изображений глиальных миграции клеток в диск дрозофилы глаз имагинальных

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Живая съемка Дрозофилы Эмбриональные миграции гемоцитов

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Препарирование Oenocytes от взрослых Дрозофилы</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Разбор и Окрашивание Drosophila Личинок Яичники

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Изоляция Дрозофилы Семенники

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Измерение продолжительности жизни в<em&gt; Дрозофилы</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Вскрытие и Монтаж<em&gt; Drosophila</em&gt; Куколочные глаз Диски

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...