Авторы хотели бы поблагодарить развития исследований Hybridoma банка в Университете штата Айова для отправки нам антител. Эта работа была поддержана грантом (№ 29/08) из Израиля научного фонда. AS также поддерживает исследования грант DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

Перед тем как начать <ol><li> Рост желаемого культуры лету. Хранить флаконы непереполненные (около 30 мух на 50 мл флакон). Пусть мухи откладывают яйца только на один день в каждом флаконе. Это обеспечит достаточное количество личинок пищей и дать им возможность достичь максимального размера до вылезая из пищи. Хранить флаконы в соответствующем температуре до третьего возраста личинки начинают бродить на флаконе стены. </li><li> Подготовить новый запас фосфатным буферным раствором (PBS) и PBT (0,1% Tween в PBS). Держите 10 мл PBS на льду. </li><li> Подготовить 1-5 мл свежего фиксатора (4% формальдегида в PBT) и держать его на льду. Мы используем бутылки 37-38% формальдегида в качестве исходного раствора. </li></ol> 1. Вскрытие и фиксации личинки третьего Инстар <ol><li> Выберите блуждающих третьей взрослой личинки из флакона стены и поместить его в 50 мкл капли ледяной PBS на тарелку Sylgard рассечение (из 184 Sylgard силиконового эластомера комплект корпорации Dow Corning вкультуры тканей блюдо). </li><li> Держите личинки, спинной стороной вверх, в районе устья крючки, с помощью тонкой щипцы (Дюмон # 5 щипцы), и придерживаться насекомых контактный (minutien, 0,1 мм, нержавеющая сталь) с помощью мозга личинок. </li><li> Возьмите задний конец личинки пинцетом, осторожно тянуть и растягивать личинку аккуратно продольно. Придерживайтесь другое насекомое контактный двух задних дыхальца. </li><li> Используя ножницы весной вырезать две горизонтальные разрезы в стенке тела (перпендикулярно передне-задней оси), недалеко от переднего и заднего контактов. </li><li> С помощью ножниц разрезать весной личиночной стенкой тела вдоль спинной средней линии от передней к задней разрез. </li><li> Удалить внутренних органов (кишечника, слюнных желез, мальпигиевых сосудов и т.д.) и трахеи с использованием тонких щипцов. Мойте мягко один или два раза PBS. </li><li> Возьмите двух створок стенки тела щипцами, растянуть их и прикрепите их к пластине с помощью двух насекомых контактов с каждой стороны. </li><li> Удалить PBS и добавить 50 мкл фиксирующем растворе (4% формальдегида в PBT). Инкубировать 20 минут при комнатной температуре. </li><li> Снимите фиксатор. Мыть два раза PBS. Вытяните насекомых булавками. Используя ножницы весной сократить личиночной голову и хвост оставить прямоугольной филе. Передача фиксированной ткани охлажденной трубки Эппендорф с PBS. </li><li> После того, как достаточное количество личинок являются фиксированными, можно продолжить непосредственно на антитела окрашивания. Если немедленно окрашивание не требуется, фиксированные личинки должны быть вымыты в 3 раза, 5 минут, с 95% этанола и хранят в 95% этанола при -20 ° C. </li></ol> 2. Вскрытие и фиксации Куколки Часть I <ol><li> Участие в ампулах, как и для личинок фиксации, до третьего возраста личинки начинают pupariate. Изучить флаконов в час и знак личинки, которые pupariated. Позвольте отмеченной куколки развиваться 30-40 часов при температуре 24 ° С, или 24-27 часов при 29 ° C. </li><li> Используя тонкий пинцет выбрать 20-30 куколок-йэлектронной соответствующего возраста и поместить их в темное фарфора мульти-и рассечения блюдо. Будьте осторожны, чтобы не повредить ткани интерес. </li><li> Извлечение из куколки куколки случае. Начнем с отшелушивающим крышечки и продолжаются до куколки бесплатно. Положить в куколку и заполнены PBT. Продолжить извлечения всех куколок. Шаги 2.4-2.6 должно быть сделано в маленьких партиях из пяти куколок одновременно. </li><li> Разместить пять куколок на ровную поверхность между скважин вскрытия блюдо. Использование микро-нож рассечение сократить кончик головы и задний конец брюшка (в качестве альтернативы, можно использовать две пары щипцов рвать отверстиями на обоих концах куколки). </li><li> Держите куколки на месте с помощью пинцета и тонких использовать 1 мл шприц промыть внутренних органов куколки, вводя PBT через передние отверстия. </li><li> Вымойте расчлененный куколки кратко, опуская его в хорошо заполнены PBS и переместить его в холодную фиксатор в пробирку Эппендорфа держится на льду. </li><li> Выдержите в течение ночи (ON) при 4 ° C. </li></ol> Часть II <ol start="8"><li> Откажитесь от фиксатора и мыть куколок три раза по 5 минут каждая, с PBT. Храните вымытые куколок на льду. </li><li> Заполнить две скважины на вскрытии блюдо с PBT. Использование полиэтиленовой пипетки Пастера передачи несколько куколок в одной из ям. </li><li> Перемещение на одну куколку в то время, во второй хорошо. С помощью двух пар острый пинцет с идеально ровные советы, снимите прозрачную куколки кутикулы крыла: обеспечить куколки на дно и с помощью одной пары щипцов и аккуратно оторвать кутикулы используя вторую пару щипцов. После того, кутикула разрывается, очистить его от крыла. Будьте осторожны, чтобы не отключать крыла из куколки. После пилинга от кутикулы от крыла лезвие, продолжают пилинг кутикулы крыла петли (там, где крыло Chos расположены). </li><li> После пилинга с крылом кутикулы, можно попытаться отшелушивающим ногу кутикулы в подобной манере.Многие ноги, вероятно, будут потеряны в процессе, но, несмотря на низкую доходность, то этот шаг рекомендуется, поскольку она значительно улучшает окрашивания ног Chos. Chos из haltere и живота могут быть визуализированы без дальнейшего отшелушивающим кутикулы. </li><li> Поместите &quot;очищенные&quot; куколки в пробирку Эппендорфа заполнены метанола и держать при комнатной температуре. Продолжить отшелушивающим кутикулы всех куколок, и добавить их к той же трубе. По меньшей мере 10 хорошо очищенные куколки должны быть собраны для каждого окрашивания. </li><li> Удалите метанол и промыть три раза, 5 минут, с 95% этанола. Исправлена ​​куколок можно хранить в течение длительного периода времени в 95% этанола при -20 ° C. </li></ol> 3. Иммуноокрашивание личинок и куколок <ol><li> Вымойте фиксированной ткани с PBT в три раза, 30 минут при комнатной температуре. Личинки можно мыть с мягким тряски на вращающейся тарелке. Куколки моются без встряхивания. </li><li> Замените PBT блокирующим буфером (PBT + 5% нormal сыворотки козьего) и инкубировать ON при 4 ° C. </li><li> Удалите блокирующий буфер и инкубировать с первичными антителами (разбавленный в блокирующем буфере) ON при 4 ° C. </li><li> Промойте в четыре раза с PBT, как описано в шаге 3.1. </li><li> Удалить PBT и инкубировать с вторичными антителами (разбавленный в блокирующем буфере) ON при 4 ° C. </li><li> Мыть два раза PBT и один раз PBS, как описано в пункте 3.1. </li><li> Замените PBS с монтажной среды (Dako флуоресцентная Монтаж среднего (Dako Cytomation, Glostrup, Дания) и инкубировать при температуре 4 ° C ON. </li></ol> 4. Монтаж Личинки <ol><li> Личинки установлены на предметное стекло в каплю монтаж средств массовой информации с их кутикулу вниз и мышцах стенки тела вверх. Нанесите небольшое падение монтажа среды на чистую скольжения крышки и использовать его для покрытия подготовки. Не применять любое давление на смонтированном личинок. </li></ol> 5. Монтаж Куколки <ol><li> Приготовьте два слайды микроскопомс каплей установки среды, по одному для вскрытия, а второй для монтажа. </li><li> Положите несколько куколок на одном из слайдов. </li><li> Используя ножницы весной удалить головы и задней части брюшной полости. </li><li> Отделите спинной половине грудной клетки от брюшной половина резки между крыльями и ногами. </li><li> Поместите расчлененные части тела куколки на втором предметное стекло в каплю решение для монтажа. Убедитесь, что крылья и ноги вытянуты и стараются свести к минимуму наложение тканей как можно больше. </li><li> Поместите каплю монтаж среды на покровным стеклом и поместить его по образцу. Не давите на смонтированном образца. </li></ol> 6. Представитель Результаты Например иммуно-окрашенных Chos третьего возраста личинка показано на рисунке 1. Этот пример показывает, хорошо растягивается брюшной сегмент, в котором семь из восьми Chos четко видны. Нейроны являются лабораторииeled с MAb22C10 (1:20, полученные от Банка развития исследований Hybridoma в Университете штата Айова), шапки, связки, шапка-приложения и клетки связки вложений помечены анти-αTub85E (1:10, Клейн и др.. 2010). Вторичные антитела для флуоресцентной окраски были Cy3 или Cy5-сопряженных anti-mouse/rabbit (1:200, Джексон Immunoresearch Laboratories). Образцы были просмотрены с помощью конфокальной микроскопии (LSM 510, Zeiss). Кластер крыла Chos на вентральной радиальные вены на 35 часов от роду куколки показано на рисунке 2. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig1.jpg" /> Рисунок 1 (А) Схематическое изображение из шести типов клеток, которые составляют единый орган Ch. Крышка крепления (CA), шапка (C), scolopale (S), нейронов (N), связки (L) и связки вложений (LA ). LCh5 орган, в котором пять Chos сгруппированы, растягивается по всей группе боковых поперечных мышц (LT1-4). Боковые продольные мышцы (LL1), вентральных продольных мышц (VL1-4) и боковые косые мышцы (LO1) также показано на рисунке. Сухожилия клеток показано, как коричневые сферы (Взято из Klein и соавт., 2010). (B) один сегмент брюшка третьего возраста личинка посмотреть на 10-кратным увеличением. Семь из восьми Chos присутствует в каждом сегменте брюшка очевидны: пять боковых органов, которые вместе образуют pentascolopidial органа (LCh5), один боковой орган (LCh1) и один из двух вентральных Chos (VChB). Нейронов (N) в Chos помечены маркером нейронной MAb 22C10 (красный). Связки (L), шапка (C) и вложений клеток (Лос-Анджелес, Калифорния) помечены анти-αTub-85E (синий). Шапка и связки клетки дополнительно помечены ХО конкретных GFP репортер укрывательство регуляторного элемента из деи локус (Нахмана и соавт., Неопубликованные данные). <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig2.jpg" /> Рисунок 2. </sЧонг&gt; крыло хордотональные органов в брюшной радиальной жилки рассматриваются в 40-кратном увеличении. Нейронов (N) отмечены нейронов 22C10 маркера (красный, B). Связки (L) и крышки (C) клетки помечены совместно с анти-αTub85E антител (синий, С) и ХО конкретных GFP репортер трансгена (Нахмана и соавт., Неопубликованные данные).

<ol>
	<li>Brewster, R., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+specification+of+type+II+sensory+neurons+in+Drosophila.">Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila.</a> Development. 121, 2923-2936 (1995).</li><li>Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+larval+locomotion+in+Drosophila+chordotonal+organ+mutants.">Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).</li><li>Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeling+the+vibes:+chordotonal+mechanisms+in+insect+hearing.">Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).</li><li>Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Johnston's+organ+in+Drosophila.">Development of Johnston's organ in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).</li><li>Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+similar+transduction+mechanisms+for+touch+and+hearing+in+Drosophila.">Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila.</a> J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).</li><li>Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+cell+adhesion+in+the+Drosophila+wing+is+mediated+by+Delilah,+a+potent+activator+of+&#946;PS+integrin+expression.">Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of &#946;PS integrin expression.</a> Dev Biol. 351, 99-109 (2011).</li><li>Field, L. H., Matheson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chordotonal+organs+of+insects.">Chordotonal organs of insects.</a> Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).</li><li>Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+interdependent+TRPV+channel+subunits,+inactive+and+Nanchung,+mediate+hearing+in+Drosophila.">Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila.</a> J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).</li><li>Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+ectodermal+attachment+cells+via+an+EGFR-dependent+mechanism+during+the+organogenesis+of+Drosophila+proprioceptors.">Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors.</a> Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).</li><li>Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=atonal+is+a+proneural+gene+that+directs+chordotonal+organ+formation+in+the+Drosophila+peripheral+nervous+system.">atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system.</a> Cell. 73, 1307-1321 (1993).</li><li>Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+proneural+gene,+atonal,+in+formation+of+Drosophila+chordotonal+organs+and+photoreceptors.">Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors.</a> Development. 121, 2019-2030 (1995).</li><li>Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TRPV+family+ion+channel+required+for+hearing+in+Drosophila.">A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila.</a> Nature. 424, 81-84 (2003).</li><li>Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proprioceptive+and+contractile+systems+in+Drosophila+are+both+patterned+by+the+EGR+family+transcription+factor+Stripe.">The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe.</a> Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).</li><li>Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+implications+of+the+unusual+spatial+distribution+of+a+minor+alpha-tubulin+isotype+in+Drosophila:+a+common+thread+among+chordotonal+ligaments,+developing+muscle,+and+testis+cyst+cells.">Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells.</a> Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).</li><li>Okabe, M., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+induction+of+chordotonal+organ+precursors+in+Drosophila+embryogenesis.">Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis.</a> Development. 124, 1045-1053 (1997).</li><li>Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spalt+modifies+EGFR-mediated+induction+of+chordotonal+precursors+in+the+embryonic+PNS+of+Drosophila+promoting+the+development+of+oenocytes.">Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes.</a> Development. 128, 711-722 (2001).</li><li>Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+molecular+design+of+the+Drosophila+antenna+as+a+flagellar+auditory+organ.">Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ.</a> Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).</li><li>zur Lage, P., Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+EGFR+and+notch+signalling+in+the+reiterative+recruitment+of+Drosophila+adult+chordotonal+sense+organ+precursors.">Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors.</a> Development. 126, 3149-3159 (1999).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Протокол, описанный в этом видео дает возможность визуализировать проприоцептивной Chos во личинок и куколки. Исследования о строении и развитии проприоцептивной Chos были до сих пор ограничены главным образом эмбриональной стадии и личиночной имагинальной дисков. Таким образом, многие аспекты более поздних стадиях развития, как личинок и взрослых Chos, остаются в основном неизвестными. Описанный протокол, в сочетании с общим генетическим инструментов у дрозофилы, может быть использована для выявления и изучения новых генов и путей, которые играют определенную роль в более поздних стадиях развития Chos. Этот протокол был оптимизирован для визуализации ХО, но она может быть адаптирована для окрашивания других тканей, таких как куколки крылья 6.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента / инструмент </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Дюмон № 5 (или № 55), щипцы, Biologie наконечник </td><td> FST </td><td> 11252-20 и 11252-10 (Или аналогичный щипцы) </td><td></td></tr><tr><td> Аустерлиц нержавеющей стали насекомых булавками, minutiens 0,1 мм </td><td> Roboz хирургические инструменты сотрудничества </td><td> RS-6083-10 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 силиконового эластомера комплект </td><td> Корпорация Dow Corning </td><td> 240.4019862 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas микро-ножницы (прямые, 7,5 см, лезвие 3 мм) </td><td> AS Mdeizintechnik GmbH </td><td> 11-590-00 </td><td> Vannas Весна Ножницы с идентичными спецификациями можно приобрести Roboz хирургические инструменты Ко </td></tr><tr><td> Орбитальный шейкер - Rotamax-120 </td><tг&gt; Heidolph </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dako флуоресцентная Монтаж среднего </td><td> Dako Cytomation, Glostrup, Дания </td><td> DK-5302392 </td><td></td></tr><tr><td> X10 PBS разработки </td><td colspan="2"> 2 г / л KCl, 2 г / л KH 2 PO 4, 80 гр / л NaCl, 21,7 г / л Na 2 HPO4.7H 2 O </td><td> Качество PBS имеет решающее значение для успеха этого протокола </td></tr><tr><td> PBT </td><td colspan="2"> PBS X1 + 0,1% Твин-20 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of proprioceptors in drosophila larvae and pupae

Проприоцепция это возможность ощутить движение или положение частей тела, реагируя на стимулы, возникающие в организме. В fruitflies и других насекомых проприоцепции осуществляется специализированными органами чувств называется хордотональные органов (Chos) 2. Как и многие другие органы, у дрозофилы, Chos развивать два раза в течение жизненного цикла лету. Во-первых, личиночной Chos развиваться во время эмбриогенеза. Затем взрослый Chos начинают развиваться в личиночной имагинальной диски и продолжают дифференцироваться во время метаморфоза. Развитие личинок Chos во время эмбриогенеза была изучена 10,11,13,15,16. Центральное место в каждом ХО является сенсорный блок состоит из нейронов и scolopale клетки. Сенсорный блок растягивается между двумя типами вспомогательных клеток, которые крепятся к кутикуле через специализированные клетки эпидермиса вложений 1,9,14. Когда личинка мухи перемещается, относительное смещение электроннойpidermal клеток вложений приводит к растяжению сенсорные устройства и последующее открытие конкретных переходный рецепторный потенциал ваниллоидных (TRPV) каналов на внешнем сегменте дендритов 8,12. Вызвало сигнал затем передается опорно-двигательного центральной цепи генератора картина в центральной нервной системе. Несколько Chos были описаны у взрослых мух 7. Они расположены вблизи суставов у взрослых мух придатки (ноги, крылья и поводов) и в области грудной клетки и живота. Кроме того, несколько сотен Chos вместе образуют орган Джонстона во взрослом антенны, преобразовывать акустические в механическую энергию 3,5,17,4. В отличие от обширных знаний о развитии Chos в эмбриональной стадии, очень мало известно о морфологии этих органов в личиночной стадии. Кроме того, за исключением бедренной Chos 18 и орган Джонстона, наши knowledGE о развитии и структуре Chos во взрослой мухи очень отрывочны. Здесь мы опишем метод окрашивания и визуализации Chos в третьем личинок и куколок возраста. Этот метод может применяться вместе с генетическими инструментами, чтобы лучше характеризуют морфологию и понять развитие различных Chos в лету.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae at JoVE.com

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Метод immunostain и визуализировать хордотональные органов у личинок и куколок<em&gt; DROSOPHILA MELANOGASTER</em&gt; Описано.

Визуализация проприорецепторов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки и куколки

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

visualization-of-proprioceptors-in-drosophila-larvae-and-pupae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

11.9K Views.  Technion-Israel Institute of Technology. Метод immunostain и визуализировать хордотональные органов у личинок и куколок DROSOPHILA MELANOGASTER Описано.

Video: Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-ячейки изображения сенсорных клеток-предшественников органов в интактных Drosophila Куколки

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Локальные и глобальные методы оценки теплового ноцицепции в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Ассоциативный аппетит обонятельного обучения в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Свет Анализ предпочтений по изучению врожденных и суточного Регулируемые Photobehavior в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetic Возмущение нейронной активности с лазерной подсветкой в ​​полу-нетронутыми<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки в движении

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Foraging Протокол Путь длиной для<em&gt; Дрозофилы</em&gt; личинки

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Новый анализ для холодной ноцицепции в<em&gt; Drosophila</em&gt; личинки

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

Количественная оценка приема макроэлементов в термогенетического нейронального экрана с использованием drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at the Drosophila NMJ enables researchers to acquire synaptic information, encompassing both quantitative data on synapse abundance and detailed insights into their morphology. However, the diffuse distribution and limited visual range of the TEM present challenges for the ultrastructural analysis. This study introduces an innovative and efficient sample preparation method that surpasses the conventional approach. The procedure begins by placing a metal mesh at the base of a flat-bottomed bottle or test tube, followed by positioning fixed larvae samples onto the mesh. An additional mesh is placed over the samples, ensuring that they are positioned between the two meshes. The fixed samples are thoroughly dehydrated and infiltrated before proceeding with the embedding procedure. Then embedding of the samples in epoxy resin is performed in a flat sheet manner, which allows for the preparation of muscles for positioning and sectioning. Benefiting from these steps, all the muscles of Drosophila larvae can be visualized under light microscopy, therey facilitating subsequent positioning and sectioning. Excess resin is removed after locating the 6th and 7th muscles of body segments A2 and A3. Serial ultra-thin sectioning of the 6th or 7th muscle is performed.

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

This report provides a new sample preparation procedure for visualizing neuromuscular junctions in Drosophila Larvae. This method is more effective in preventing the curling of the samples compared to the traditional method and is particularly useful for Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

Оптимизация процесса пробоподготовки для просвечивающей электронной микроскопии нервно-мышечных соединений личинок дрозофилы

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

Просмотр сети микротрубочек в нервно-мышечных соединениях и мышечных клетках дрозофилы

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

В центре внимания автора: Понимание сети микротрубочек в нервно-мышечных соединениях дрозофилы 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.