Эта методология анализа является важным достижением в знаниях о клеточном иммунитете против малярии на стадии крови, помогая выявить новые терапевтические цели и ускорить прогресс вакцины против малярии. Создание анализа плазмодия in vitro, который может быть использован для образцов человека или животных, ценно для лучшего понимания патогенеза малярии. Защитный иммунитет к малярии до конца не изучен.
Для разработки новых методов лечения необходимо изучить механизмы клеточного иммунитета к малярийной паразитарной стадии. Продемонстрировать процедуру будут я, Луна де Ласерда и Кристофер Гомес, студент бакалавриата из лаборатории Кэролайн. Для начала аспирируйте 100 микролитров раствора гепарина в одномиллилитровый шприц иглой 26-го калибра.
Положите мышь на бок и перпендикулярно введите иглу чуть ниже локтя, через ребра и в сердце. Медленно вытащите поршень шприца и вращайте иглу до тех пор, пока не получится от 0,5 до одного миллилитра крови. Асептически очистите левую сторону мыши 70% этанолом.
Хирургическими ножницами сделайте надрез с левой стороны мыши, пройдя через кожу и брюшину. Найдите селезенку и удалите ее. Поместите селезенку мыши в чашку Петри с пятью миллилитрами полной среды, чтобы очистить желаемую популяцию эффекторных клеток.
Поместите 100-микромолярный клеточный сетчатый фильтр на 50-миллилитровую коническую трубку и перенесите иссеченную селезенку в клеточный фильтр с помощью анатомических щипцов. Разомните селезенку через ситечко с помощью поршня шприца. Промойте ячейки через ситечко 10 миллилитрами готовой среды.
Центрифугируйте клетки при 300 G в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию. Затем выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в двух миллилитрах холодного буфера для лизиса эритроцитов и инкубируйте суспензию в течение пяти минут на льду.
Промойте клеточную суспензию 10 миллилитрами полной среды с температурой четыре градуса по Цельсию и удалите все клеточные сгустки между промывками селезенки у мышей, инфицированных плазмодием. Центрифугируйте клетки при 400 G в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Затем выбросьте надосадочную жидкость.
Теперь поместите колонку LS или LD в магнитное поле и подготовьте колонку, промыв ее тремя миллилитрами буфера MACS. Затем нанесите клеточную суспензию на колонку. После трехкратной промывки колонки тремя миллилитрами буфера MACS соберите проточный поток, содержащий клетки селезенки.
Соберите 10 микролитров клеток селезенки и добавьте 10 микролитров трипанового синего, чтобы проверить жизнеспособность клеток. Добавьте клетки в гемоцитометр. Подсчитайте спленоциты в растворе трипанового синего и проверьте жизнеспособность клеток.
Центрифугируйте все спленоциты и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендировать гранулы клетки в 40 микролитрах буфера MACS. Добавьте в клетки 10 микролитров коктейля антител к биотину, хорошо перемешайте и выдержите пять минут на льду.
После инкубации микрогранул антибиотина на льду в течение 10 минут поместите колонку MACS LS в подставку магнитного поля и подготовьте колонку, промыв ее тремя миллилитрами буфера MACS. Нанесите клеточную суспензию на колонку. Трижды промойте колонку тремя миллилитрами буфера MACS и соберите проточный поток, содержащий все немеченые цитотоксические клетки.
После центрифугирования собранной крови в дозе 350 раз G в течение пяти минут откажитесь от сыворотки и ресуспендируйте кровь в одном миллилитре RPMI без FBS. После помещения колонки LS в опору магнитного поля промойте RPMI и пропустите суспензию эритроцитов через колонку. После того, как клетки проходят через колонку, центрифугируйте проточку, отбрасывайте надосадочную жидкость и повторно наносите один миллилитр проточной жидкости в колонку, чтобы изолировать больше iRBC.
Дважды промойте колонку пятью миллилитрами RPMI. Выполните шаги промывки, добавив аликвоты буфера, как только резервуар колонны опустеет. Добавьте пять миллилитров RPMI, снимите колонку и продуйте iRBC в новую 15-миллилитровую пробирку.
Разведите один микролитр 10-миллимолярного раствора CFSE в одном миллилитре RPMI без FBS. После ресуспендирования эритроцитов в 500 миллилитрах RPMI без FBS добавьте 500 миллилитров разбавленного CFSE и выдерживайте в течение восьми минут при комнатной температуре, защищенной от света. Трижды промойте клетки 14 миллилитрами полной среды и дважды центрифугируйте клетки.
Для совместного культивирования цитотоксических лимфоцитов поместите клетки в 96-луночную пластину с круглым дном. Добавьте очищенные лимфоциты и меченные CFSE iRBC в желаемом соотношении эффектор/клетка-мишень к конечному объему 200 миллилитров и гомогенизируйте. Подготовьте каждое условие в трех экземплярах и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов по Цельсию.
iRBC были очищены от мышей, инфицированных P.yoelii, с использованием колонок LS. Очищение подчеркивается мазками крови из крови, собранной до и после обогащения колонки. Стратегия стробирования, необходимая для оценки процента лизиса эритроцитов, представлена здесь.
Стопорные ворота установлены в популяции счетных бусин. Стратегия стробирования начинается с выбора отдельных ячеек, исключая мусор, на основе отношения высоты пика прямого рассеяния к площади, за которым следует выбор популяции эритроцитов в Ter119+ и CD8-Затем выбираются живые IBC как CFSE с высоким положительным результатом. Вот анализ, примененный к экспериментальному примеру с использованием различных соотношений эффекторов и мишеней, отображающих живые эритроциты после совместной культуры.
Показано графическое представление процента лизиса эритроцитов, рассчитанное по этой формуле. Значимость между группами, использующими цитотоксический CD8 или наивный CD8, оценивали с помощью двусторонней ANOVA с множественными сравнениями. Современный метод исследует лизис эритроцитов путем прямого контакта клеток с клетками-киллерами, и можно планировать раскрытие задействованных механизмов с использованием блокирующих антител к специфическим рецепторам или молекулам.
Этот анализ уничтожения in vitro представляет собой новую стратегию для выяснения механизмов клеточно-опосредованного иммунитета к малярии в крови, что поможет прогрессу новых методов лечения малярии и вакцин.
