Методика позволяет изучать функцию и диапазон сигнальных молекул при эмбриогенезе путем трансплантации эктопических источников сигнализации. Это также способствует эффективной генерации мутантов зародышевой линии. Протокол может быть применен к эмбрионам данио и медаки стадии бластулы, а также, вероятно, к другим эмбриональным стадиям и видам TDO.
Чтобы собрать устройство для трансплантации, подключите наконечник приманки 25 микролитров с газонепроницаемым шприцем к держателю микропипетки с помощью крепления замка приманки. Затем установите устройство непосредственно на ручной микроманипулятор. Чтобы использовать устройство для трансплантации, поместите микроманипулятор с собранным устройством рядом со стереомикроскопом.
Затем извлеките поршень и вставьте иглу для трансплантации. Опустите иглу в тарелку, наполненную раствором Рингера под углом 45 градусов, пока кончик иглы не будет погружен. Вставьте плунжер примерно наполовину, чтобы промыть растворы Рингера, оставив только небольшой объем воды в тонкой конической части иглы.
При использовании трансплантационной иглы в первый раз покройте внутреннюю часть иглы, вытянув ярмо из принесенного в жертву эмбриона и полностью изгнав материал хомута. Затем, используя иглу для трансплантации, аккуратно позиционируйте донорский эмбрион, затем позиционируйте открытие иглы ортогонально к поверхности эмбриона и осторожно потяните поршень, чтобы втянуть клетки в иглу. Как только нужное количество клеток будет втянуто, остановите всасывание, осторожно толкнув плунжер вниз и извлеките иглу из эмбриона, дергая иглу в сторону коротким и быстрым движением.
Оставьте немного раствора Рингера по обе стороны клеточного столба, ограничив ячейки коническим концом иглы. Очистите оставшийся желток или клеточный мусор, медленно перемещая поршень вверх и вниз и промывая клетки раствором Рингера. Затем переместите тарелку для трансплантации недоминирующей рукой, чтобы расположить иглу ортогонально к поверхности эмбриона-хозяина.
Приложите небольшое давление на эмбрион, осторожно прижав его к стенкам. Затем быстрым резким движением проткните обволакивающий слой эмбриона хозяина, следя за тем, чтобы не поцарапать желток иглой. Как только игла окажется внутри, осторожно протолкните поршень, чтобы выдавить столб клеток в эмбрион, и медленно втягивайте иглу одновременно.
Для трансплантации половых клеток заполните тарелку для трансплантации раствором Рингера, затем перенесите дехорионированную сферу на купольную стадию эмбрионов в чашку для трансплантации и поместите эмбрионы хозяина и донора в чередующиеся столбцы для пересадки клеток от одного донорского эмбриона к шести различным эмбрионам хозяина. Для проведения трансплантации ориентируйте эмбрионы с запасом в сторону иглы для трансплантации. Для трансплантации зародышевой линии возьмите исходные клетки с края и поместите их в то же место в эмбрионе хозяина.
Как только трансплантация будет завершена, позвольте эмбриону восстановиться в растворе Рингера в течение от 30 минут до одного часа. Затем с помощью флуоресцентного стереомикроскопа исследуют пересаженные клетки. Затем перенесите эмбрионы в 24-луночную пластину, покрытую агарозой, с эмбриональной средой, группирующей все эмбрионы-хозяева, которые получили клетки от одного и того же донора, в один и тот же колодец.
Затем высиживают эмбрионы при 28 градусах Цельсия до следующего дня. При необходимости перенесите донорские эмбрионы в меченые полоски ПЦР для генотипирования. Через 30 часов после оплодотворения проведите скрининг эмбрионов-хозяев для успешной трансплантации зародышевой линии под флуоресцентным стереомикроскопом.
Половые клетки должны присутствовать в канавке над расширением желтка. Вырастите успешно пересаженную личинку во взрослую жизнь в соответствии со стандартными условиями животноводства. При успешных трансплантациях эмбрион выглядит нормальным и похожим по форме и желточности на нетрансплантированные эмбрионы без больших разрывов в бластодерме.
Напротив, если эмбрион заметно поврежден во время трансплантации, он не будет развиваться нормально. Хотя устройство для трансплантации в основном использовалось на эмбрионах рыбок данио на стадиях бластулы, трансплантация и экстирпация клеток также могут быть проведены в дехорионированных эмбрионах стадии бластулы японской рисовой рыбы медака. В конкретном случае трансплантации зародышевой линии хорошая трансплантация приводит к эмбриону с длинным горизонтальным столбом клеток непосредственно над краем желтка.
Однако успех процедуры может быть оценен только после 24-30 часов оплодотворения, когда половые клетки отличаются по своей флуоресценции от соматических клеток. Первичные половые клетки будут появляться в виде небольших флуоресцентных сфер в канавке непосредственно над расширением желтка. Наличие этих половых клеток в правильном месте указывает на успешную трансплантацию зародышевой линии.
Примеры неудачных трансплантаций приведены здесь. В первом примере, хотя половые клетки достигли мезодермы гонады, поскольку эмбрион хозяина сильно деформирован, он не будет развиваться нормально. Во втором примере флуоресцентные клетки обнаруживаются только вне канавки.
Эти клетки являются либо соматическими клетками, либо половыми клетками, которые не смогли правильно мигрировать. И оба типа клеток не будут способствовать зародышевой линии эмбриона. Очень важно избегать повреждения трансплантированных клеток и эмбриона хозяина.
Клетки должны быть составлены медленно, очищены от оставшегося желтка и аккуратно вставлены. Этот метод обеспечивает простой способ трансплантации клеток эмбрионов рыбок данио и будет полезен для генерации эктопических источников и мутантов зародышевой линии. Главное преимущество этого устройства, это невысокая стоимость, а также много и используется.
