Name: dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster
Uploaded: 2014-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
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우리는 JPK에게 원래의 가상적인 디스크 해부 절차를 가르치는 도널드 준비와 케빈 모세에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 그림 1B의 성기 디스크와 그림 3 그림 2A, 브랜든 Weasner의 눈 디스크의 보니 Weasner 감사 플라이 얼룩에 대한 블루밍턴 초파리 주식 센터 및 항체 발달 연구 하이 브리 도마 은행. CMS는 건강 (NIH) GCMS 교육 그랜트의 국립 연구소 (T32-GM007757), 프랭크 W. 퍼트 냄 연구 활동, 그리고 로버트 브릭스 연구 활동에서 장학금으로 지원하고있다. JPK는 국립 안과 연구소의 연구비 지원 (R01 EY014863)

애벌레의 1 준비 <ol><li> 해부 버퍼 35mm 페트리 접시를 채 웁니다. </li><li> 페트리 접시에 유충을 배치하고 몇 분 (자동 세척 단계) 주위에 수영을 할 수 있습니다. </li><li> 실리콘 기반의 해부 접시에 해부 버퍼 풀에 유충을 전송합니다. 이 풀은 판의 한 가장자리에 있어야합니다. 해부 판 유리 페트리 접시 내에 부어 경화 된 실리콘 용액 이루어져있다. </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여-, 박리 판의 중간에 박리 완충액 큰 풀을 배치. </li><li> # 5 집게를 사용하여 절개 버퍼의 큰 풀에 작은 수영장에서 단일 청소 유충을 전송합니다. </li></ol> 유충의 2 거친 해부 <ol><li> 유충은 해부 버퍼의 대형 수영장 내에있는 동안 집게로 유충을 걸쇠. 포셉의 다른 쌍 ANIM을 보유하는 데 사용되는 동안 집게 한 쌍의 입 후크를 잡기 위해 사용되어야한다알은 여전히​​ (3 분의 몸 길이의 부드럽게 유충을 잡아). </li><li> 신속 포셉 번째 쌍 얻어 신체의 나머지 부분을 당기는 동안 입 후크 근처 표피를 함유하는 핀셋의 쌍을 고정하거나. </li><li> 유충이 뿔뿔이하기 시작하면 당신은 긴장에 약간의 방출을 느낄 것이다. 포셉에서 유충을 해제하고 밖으로 유출하는 유충의 &quot;용기&quot;를 할 수 있습니다. 이것은 정상적인 형태를 유지하기 위해 가상적인 디스크의 수 및 변형되는 것을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 겸자 일쌍 제자리에 유충의 전방 단부를 유지하도록 다시 입 후크 파악. 사용 포셉의 다른 쌍은 내부 용기를 포함하여 유충의 2/3 하부를 제거합니다. 참고 : 입 후크, 눈 더듬이 디스크, 뇌 반구, 복부 신경절, 침샘, 일부 다리 디스크를 포함하는 복잡하고, 위에있는 표피가 유지됩니다. </li><li> 집게의 쌍으로 부드럽게 상부 표피, 침샘, 다리 디스크 및 제거다른 조직. 참고 : 입 후크, 눈 더듬이 디스크, 뇌 반구입니다 남아 있어야 조직 및 복부 신경절 (그림 3). </li><li> 반복은 15 ~ 20 분 동안 추가 애벌레 2.1-2.5 단계를 반복합니다. 주 : 오랜 기간 동안 해부 버퍼 내에 남아있는 가상적인 디스크 성능이 저하하는 경향이 궁극적으로 촬영되는 이상적인 표본 이하로 나타납니다. 따라서, 모든 해부 조직을 고정액 PLP로 전송해야 20 분 후 최대 (아래 참조). </li></ol> 항체와 3 고정 및 조직의 염색 <ol><li> P-200 pipetman을 사용하여, 냉간 파라 포름 알데히드-리신-요오 (PLP)를 포함하는 정착액 시계 접시로 해부 조직을 전송. 50 μL로 전송 해부 버퍼의 제한 볼륨은 PLP의 희석을 최소화합니다. 팁 개방 해부 조직을 수용 할 수있을만큼 큰 수 있도록 면도날과 팁을 끊어야합니다. 집게의 쌍을 사용하거나텅스텐 바늘 해부 조직이 완전히 적절한 고정이 발생하기 위해서는 침수되어 있는지 확인합니다. 45 분 동안 차가운 PLP의 정착액의 해부 조직을 품어. 이 배양 교반하지 않고 실온에서 일어날 수있다. </li><li> P-200의 pipetman를 사용하여 45 분 동안 다른 잘라 노란색 팁을 사용하여 버퍼를 씻어 (RT)를 해부하는 조직을 전송합니다. 50 μL로 전송 PLP의 제한 볼륨은 세척 버퍼의 희석을 최소화합니다. 참고 : 모든 해부 조직이 완전히 침수되어야한다. </li><li> 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 해부 조직의 20 ~ 30 세트를 전송합니다. 주 : 눈 더듬이 디스크 착체의 번호가 큰 튜브 내에 결합하는 경우, 상기 튜브의 하단에 조직이 항체에 노출 적절하지 않을 가능성이있다. 최적의 결과를 위해 더 이상 20 ~ 30 눈 더듬이 디스크 단지 하나의 튜브 내에서 본 제품을 장착 할 수 없습니다. 해부 조직은 미세 원심 분리 튜브의 바닥에 정착됩니다. 따라서, 후속 단계 U를제거하고 세척 버퍼 차단 솔루션 및 항체를 대체 할 pipetman를 SE는. </li><li> 세척 버퍼를 제거하고 차단 솔루션을 100 ㎕로 교체 : 세척 버퍼 10 % 정상 염소 혈청. 10 분 동안 테이블 위에 회전에 부드러운 회전을 RT에서 품어. </li><li> 차단 솔루션을 제거하고 적절하게 10 % 정상 염소 혈청 희석 된 일차 항체를 100 ㎕로 교체합니다. 16 시간 동안 부드러운 회전을 RT에서 품어. </li><li> 일차 항체를 제거하고 세척 버퍼 750 μL로 교체합니다. nutator에 튜브를 넣고 실온에서 10 분 동안 nutate 할 수 있습니다. 참고 : 차 항체 (4 ° C에 저장)를 저장하고 나중에 재사용 할 수 있습니다. 항체를 여러 번 재사용하면 비 특정 바인딩을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 헤드 후, 튜브의 바닥에 침전 세척 완충액을 제거하고 적절 10 % 정상 혈청으로 희석 된 이차 항체 100 ㎕를 추가 할 수있다. 부드러운 회전과 RT에서 품어 2̵일 4 시간. </li><li> 조직에서 차 항체 솔루션을 제거하고 세척 버퍼 500 μL로 교체합니다. 조직 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다. </li><li> P-200과 절단 황색 팁을 사용하여, 해부 접시에 배치 된 세척 버퍼의 풀에있는 모든 해부 조직을 옮긴다. 미세 절개의 다음 단계를 진행하는 동안, 조직을 세척 완충액에 배양한다. 이 과잉 차 항체를 제거하는 데 도움이됩니다. </li></ol> 4 아이 - 더듬이 디스크 단지의 미세 해부 및 슬라이드에 장착 <ol><li> 아래로 향 복합체의 복부 측면과 입 후크에 의해 표피를 걸쇠 집게 한 쌍을 사용합니다. 집게의 두 번째 쌍의 뇌와 눈 디스크 사이의 공간에 (그림 3, 빨간색 화살표)를 두 번째 집게를 폐쇄하고 신속하게 입 고리에서 떨어져 머리를 잡아 당겨 두 뇌 엽 (叶)을 제거합니다. </li><li> 입 후크 지키고 계속하는 동안, 핀치 오프눈 더듬이 디스크 더듬이 부와 입 후크 (도 3, 청색 화살표) 사이의 연결에 최대한 가깝게 조직. 주 : 눈 더듬이 디스크 단지 모든 조직 (그림 1A)이 없어야합니다. 슬라이드에 배치 할 수 있습니다 원하는 원하는 모든 조직을 해부 할 때까지 계속합니다. 이 프로토콜은 날개 haltere, 다리 및 생식기 가상적인 디스크 (도 1b-E)를 격리하도록 구성 될 수있다. </li><li> 티슈 페이퍼의이 작은 조각 (커버 슬립의 사이즈) 약 3를 추가합니다. 떨어져 해부 접시에. 접시 위에 슬라이드 유리를 배치 - 휴지 두 조각의 슬라이드 단부하에 있어야한다. 이 해부 접시의 실리콘베이스에 달라 붙는 슬라이드를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 도련 끝 P-20을 이용하여, 유리 현미경 슬라이드의 중간 항 표백제 9 μL를 추가한다. 형광으로 볼 때 조직의 탈색을 방지빛. </li><li> 같은 포경 팁을 사용하여, 모든 눈 더듬이 디스크를 수집 및 안티 표백 시약의 드롭에 추가합니다. 위에 수행되는 세척 버퍼의 양을 최소화한다. 10 μL 이하로 세척 버퍼의 양을 제한하려고합니다. </li><li> 분리 및 안티 표백 시약의 드롭 내 눈 더듬이 디스크를 확산 집게 한 쌍을 사용합니다. 디스크가 몇 분 동안 반 표백 시약에 부화 할 수 있습니다. 참고 : 조직 반 표백 시약을 흡수으로 디스크가 분명집니다. </li><li> 좋은 붓을 사용하여 부드럽게 시편 상에 커버 슬립을 낮 춥니 다. 이 기포의 형성을 방지한다. </li><li> 스토어 빛 또는 형광 현미경을 사용하여 눈 더듬이 또는 다른, 상상 디스크를 볼 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 슬라이드. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

이 절차는 크게 분리 눈길 더듬이 디스크의 후속 처리에 초점을 맞추고 있지만, 그것을 분리하고 날개 haltere, 다리 및 생식기 디스크 (도 4)을 분석하는데 사용되는 의무가있다. (눈 더듬이 디스크와는 대조적으로) 이러한 디스크를 분리하는 프로토콜의 유일한 필수 변형 조대 해부 (프로토콜의 섹션 2)의 방법이다. 제 흉추 레그 (T1) 쌍 유충의 앞쪽에서 발견되어 눈길 더듬이 디스크 절...

한 세기 이상 초파리, 초파리의 경우, 개발, 행동과 생리학을 연구하는 최고의 시스템이다. 후자의 촬영 장소의 대부분과 배아 및 사후 배아 단층 상피 내에서 가상적인 디스크 1-3 전화 : 파리의 개발은 크게 두 단계로 나눌 수 있습니다. 가상적인 디스크의 그림은 첫번째 곤충 개발 한 그의 광범위한 논문의 일부가 오는 8 월 Weismann에 의해 1864 년에 출판되었다. 이러한 디스크는 1-14 플라이 성인에서 발견되는 성인 구조물의 높은 비율을 야기 궁극적으로 조기 번데기 단계 대규모 histolysis 생존하고, 유생 단계 동안 패턴 화되고, 배아 발생 동안 그들의 발전을 시작한다. 애벌레 개발 과정에서 각 디스크의 운명, 모양과 크기에 관한 몇 가지 중요한 결정을합니다. 제 1 및 제 2 령 유충 내 디스크는 일차 운명을 취 establis을 주어 아르정확한 형상을 채용하고 15-16 세포의 필요한 수를 생성 구획 경계 힝. 셋째 애벌레 령 초 전 번데기의 단계에서, 상상 디스크는 계속 분열 및 세포가 자신의 단말기 운명 16을 채택으로 패턴 화되어있다. 초파리 발달 생물학의 초기 역사 동안, 가상적인 디스크는 정상적인 발달의 컨텍스트에서 그리고 손실이나 기능 획득 돌연변이가 생존시킨 제한된 경우에 거의 독점적으로 연구되었다. X 선의 사용은 치명적인 돌연변이 허용 유사 분열 재조합이 유충 및 성인의 조직 내의 세포 클론에서 분석 될 유도. 이 방법은 유충 및 성인 조직 모두에서 돌연변이 손실을 분석하여 기능 획득하는 형질 전환 방법의 도입에 의해 개선되었다. 야생형 및 돌연변이 분자의 조직을 설명하기위한 프리 항체, 전사 리포터 단백질 트랩 번호도이다 CONSTantly 성장. 돌연변이 세포 클론을 손실을 분석하여 기능 획득하기 위해 이들 분자 표지 사용은 점점 실현 돌연변이 세포를 개발하는 동안 그들의 야생형 사촌 이탈 방법의 실시간 이해하도록했다. 적절 이러한 도구 및 시약을 이용하려면 그것은, 볼 촬영하고 분석 할 수 디스크의 가상적인 고품질 제제를하는 것이 중요하다. 이 원고의 목적은 눈 더듬이 디스크 착체 (도 1a)의 분리 및 제조를위한 최적의 프로토콜을 제공하는 것이다. 또한 성공적 날개 halteres, T1-T3의 다리와 성기 (도 1b-E)을 야기 된 것을 포함하여 부가적인 디스크의 다양한 분리하는데 사용될 수있다. 약간의 수정이 절차는 거의 팔십년에 초파리에서, 상상 디스크를 분리하기 위해 사용되어왔다. 대부분의 유전자 뮤 중에 발현되므로 같이, 상술개발 및 조직의 다양한 단계에서 ltiple, 그것은 동물 셋째 령 유충 단계 전에 잘 죽으면 널 돌연변이가 전체 눈에 미치는 영향을 연구하는 것이 불가능하다. 네 방법은 훨씬 더 다루기 쉬운 망막으로 더 많은 개발 조직의 연구를 만들었습니다. 첫째는 달리 야생형 조직 내에 17-19 돌연변이 세포 클론을 생성 Flippase (FLP) / Flippase 재조합 타겟 (FRT) 방법이다. 이때 돌연변이 조직은 녹색 형광 단백질 (GFP)로 시각적 마커의 부재에 의해 식별되며, GFP가 존재하는 야생형 주변 조직 (도 2D)에 비교 될 수있다. 두번째 유전자는 셀 (20)의 집단에서 발현되는 &quot;FLP 아웃&quot;방법이다. 이 경우 세포 클론은 GFP 기자 부족 주변 야생 형 조직 (그림에 GFP의 존재에 의해 확인 및 비교2E). 세 번째는 FLP / FRT 돌연변이 복제 및 FLP 아웃 발현 시스템 (21)의 요소를 결합 Repressible 세포 마커 (MARCM) 기법과 모자이크 분석이다. 이 방법은 유전자를 동시에 개별적 유전자 유전자좌위한 돌연변이이다 세포 집단 내에서 표현 될 수있다. FLP 아웃 클론 마찬가지로 MARCM 클론 GFP의 존재에 의해 식별되고 GFP 마커 (도 2F)를 결여 주변 야생형 조직과 비교된다. 그리고 마지막으로, 유전자의 RNAi 구성체는 특정 프로모터 GAL4 구조의 제어에 가상적인 조직 내에서 발현 될 수있다. 돌연변이 또는 과발현 클론 또는 패턴이 직접 인접 야생형 조직과 비교 될 수 있기 때문에 이러한 네 가지 방법은 가상적인 디스크를 연구에 관심이 증가하고있다. 이 절차에 설명 된 방법이 개발되어 있기 때문에 초파리에서 성인 조직 후 배아 발달을 연구 연구자특히 눈 더듬이 디스크에서 유래 된이 분석을 위해 고품질의 조직을 얻을 수있을 것입니다. 개별 연구자가 약간의 수정을 만들었습니다 있지만,이 절차 (우리는 여기에 설명되는)의 핵심은 크게 변경되지 않은 채 남아있다. 높은 품질의 조직을 얻는 것은 우리가이 기록 된 프로토콜과 첨부 된 동영상이 귀중한 교육 자원이 될 것입니다 희망, 상상 디스크의 연구에 매우 중요하기 때문에.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5 KG</td><td>Used to create base for dissection plate</td></tr><tr><td>Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm</td><td>Dow Corning</td><td>3160-152CO</td><td>Use the cover for dissection plate</td></tr><tr><td>#5 Dissecting Forceps</td><td>Ted Pella</td><td>525</td><td>Forceps must be kept very sharp</td></tr><tr><td>9 well watch glass</td><td>Vairous Vendors</td><td></td><td>Used for fixation of imaginal disc complexes</td></tr><tr><td>50 ml Erlenmeyer Flask</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small Stir Bar</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Small enough to fit into Erlenmeyer Flask</td></tr><tr><td>50 ml Conical Tubes</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microfuge Tubes</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Clear or Dark depending upon application</td></tr><tr><td>Microfuge Rack</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Rotator</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>100 &amp;#956;l volume should not splatter at low setting</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Macron Chemicals</td><td>2-26555-1</td><td>Serves as fixative</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-3139</td><td>Used to make dissection and wash buffers</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>71636</td><td>Used to make dissection and wash buffers</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Acros Organics</td><td>125221000</td><td>Used in the fixative solution</td></tr><tr><td>Sodium Periodate</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-1878</td><td>Used in the fixative solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>MTX1568-1</td><td>Used to perforate imaginal discs</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>EM Science</td><td>SX0593-3</td><td>Used to dissolve paraformaldehyde</td></tr><tr><td>100% Normal Goat Serum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>Serves as a blocking solution</td></tr><tr><td>Primary Antibodies</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td></tr><tr><td>Secondary Antibodies</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Molecular Probes</td><td>H-1000</td><td>Prevents bleaching of samples</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fischer Scientific</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>Glass Cover Slips 18 x 18 mm</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe Tissue</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Prevents Glass slides from adhering to silicone base</td></tr><tr><td>Panit Brush 000</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Use to gently lower coverslip on to samples</td></tr></tbody></table>

dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster

후 배아 초파리에서 개발, 초파리의 중요한 부분은 가상적인 디스크라고 불리는 주머니 같은 구조의 집합 내에서 일어난다. 이러한 디스크는 성인 플라이 내에 발견되는 성인 구조물의 높은 비율을 야기. 여기에서 우리는이 디스크를 복구하고 항체, 전사 기자 단백질 트랩과 분석을 준비하기 위해 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 가장 가상적인 디스크 등 얇은 조직에 적합하지만, 용이하게 애벌레 및 성인 뇌 난소 조직과 같이 두꺼운 용도 변경 될 수있다. 서면 프로토콜과 함께 제공되는 동영상은 세번째 령 유충, 조직의 고정 및 항체, 상상 디스크 치료의 절개를 통해 독자 / 시청자를 안내합니다. 프로토콜은 또한 이하의 제 1 및 제 2 령 유충으로부터 가상적인 디스크를 해부하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜의 장점은 상대적으로 짧은 것을이며 수있다해부 조직의 높은 품질의 보존을 위해 최적화 도중에. 또 다른 장점은 사용되는 고정 절차가 초파리 단백질을 인식하는 항체의 압도적 인 숫자로 잘 작동한다는 것입니다. 우리의 경험에 의하면,이 절차를 잘 작동하지 않는 민감한 항체의 매우 작은 수는있다. 이러한 상황에서, 치료는 우리가 해부 단계와 항체 배양을 위해 규정 한 가이드 라인을 따라 계속하는 동안 다른 고정 칵테일을 사용하는 것으로 나타납니다.

확실히 상술 된 방법은 인 시츄 프로브, 전사 리포터 단백질 트랩과 함께 항체의 분석을위한 높은 품질의 재료를 생성한다. 그림 1에서 우리는 정기적으로이 방법으로 회수 눈 안테나, 생식기, 날개, haltere과 다리 디스크를 표시합니다. 이러한 디스크는 F-액틴에 결합하기 때문에 각각의 셀을 설명 phalloidin - 복합 형광 물질로 처리되어있다. 조직은 다음 제대로 눈 디스크?...

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Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서<em&gt; 초파리</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

26.6K 조회수.  Indiana University. The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

비디오: Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila Melanogaster에서 애벌레 CNS의 해부

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

연구

생물학

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

셋째 Instar Drosophila의 유충에서 Imaginal 디스크의 해부

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

의 활성 영역의 해부 및 이미징 Drosophila 신경근육학 융티온

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

신경과학

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

발생학

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry<em&gt; Drosophila</em&gt; 망막

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries made using this system have taken advantage of the spatiotemporal nature of photoreceptor differentiation in the developing eye imaginal disc. To use this system it is first necessary for the researcher to learn to identify and dissect the eye disc. We describe a novel RFP reporter to aid in the identification of the eye disc and the visualization of specific cell types in the developing eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc from third instar larvae and describe how the eye-RFP reporter can aid in this dissection. This eye-RFP reporter is only expressed in the eye and can be visualized using fluorescence microscopy either in live tissue or after fixation without the need for signal amplification. We also show how this reporter can be used to identify specific cells types within the eye disc. This protocol and the use of the eye-RFP reporter will aid researchers using the Drosophila eye to address fundamentally important biological questions.

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

We describe a novel red fluorescent protein (RFP) reporter that is expressed specifically in the Drosophila eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc and how this reporter can be used to aid in the dissection and identification of specific cell types in the developing eye.

에있는 아이 Imaginal 디스크의 시각화에 도움을 소설 RFP 리포터 Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the developmental mechanisms that generate neural diversity and drive circuit assembly. Given its complex three-dimensional organization, analysis of the optic lobe requires that one understand how its adult neuropils and larval progenitors are positioned relative to each other and the central brain. Here, we describe a protocol for the dissection, immunostaining and mounting of larval and adult brains for optic lobe imaging. Special emphasis is placed on the relationship between mounting orientation and the spatial organization of the optic lobe. We describe three mounting strategies in the larva (anterior, posterior and lateral) and three in the adult (anterior, posterior and horizontal), each of which provide an ideal imaging angle for a distinct optic lobe structure.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

This protocol describes three steps to prepare larval and adult Drosophila optic lobes for imaging: 1) brain dissections, 2) immunohistochemistry and 3) mounting. Emphasis is placed on step 3, as distinct mounting orientations are required to visualize specific optic lobe structures.&#160;

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization(시신경엽 시각화를 위한 유충 및 성체 초파리 뇌의 해부, 면역조직화학 및 마운팅)

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila Pupal의 복부 Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

해부와의 설치<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 아이 디스크

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서

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