نود أن نشكر دونالد جاهز وكيفن موسى لتعليم JPK وتخيلي إجراء تشريح القرص الأصلي. كما نشكر بوني Weasner للقرص الأعضاء التناسلية في الشكل 1B والقرص العين في الشكل 2A، براندون Weasner عن الشكل 3، ومركز بلومينغتون الأسهم ذبابة الفاكهة ذبابة عن البقع والضفة الدراسات التنموية ورم هجين عن الأجسام المضادة. وقد تم دعم CMS بواسطة راتبا من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) GCMS التدريب المنحة (T32-GM007757)، وجورج بوتنام زمالة أبحاث فرانك، وزمالة أبحاث روبرت بريجز. ويدعم JPK من خلال منحة من المعهد الوطني للعيون (R01 EY014863)

1. إعداد يرقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء طبق بيتري 35 ملم مع عازلة تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اليرقات في طبق بتري والسماح لهم تسبح حولها لبضع دقائق (الخطوة التنظيف الذاتي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل اليرقات إلى مجموعة من العازلة تشريح على طبق تشريح القائمة على السيليكون. يجب أن تكون على حافة واحدة من لوحة هذا التجمع. تتكون لوحة تشريح حل السيليكون التي تم سكب وتصلب داخل طبق بتري الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الماصة باستور، ضع مجموعة أكبر من العازلة تشريح في منتصف لوحة التشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام # 5 ملقط، نقل يرقة واحدة تنظيفها من تجمع صغير إلى مجموعة أكبر من العازلة تشريح. </li></ol> 2. الخشنة تشريح اليرقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين اليرقة لا تزال ضمن مجموعة كبيرة من العازلة تشريح قفل اليرقة مع ملقط. زوج واحد من ملقط ينبغي أن تستخدم للاستيلاء على السنانير الفم بينما يتم استخدام زوج آخر من ملقط لعقد أنيمالله لا يزال (والاستيلاء على يرقة بلطف في 1/3 طول الجسم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثابتا زوج من ملقط تحتوي على بشرة بالقرب من السنانير الفم حين سحب بسرعة بقية الجسم بعيدا مع الزوج الثاني من الملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تبدأ اليرقة بتمزيق ستشعر بيان طفيف في التوتر. الافراج عن يرقة من ملقط والسماح ل &quot;الشجاعة&quot; لليرقة لسفك بها. وهذا يسمح للأقراص تخيلي أن تبقى في التشكل وضعها الطبيعي ويمنعهم من التعرض للتشوه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج واحد من ملقط فهم السنانير الفم مرة أخرى لعقد الواجهة الأمامية لليرقة في مكان. استخدام زوج آخر من ملقط إزالة 2/3 أقل من اليرقات بما في ذلك الشجاعة الداخلية. ملاحظة: ستكون معقدة تحتوي على السنانير الفم، وأقراص العين antennal، نصفي الدماغ، والعقدة البطنية، والغدد اللعابية، وبعض الأقراص الساق، ويبقى بشرة المغطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج من ملقط إزالة بلطف بشرة المغطي، والغدد اللعابية، وأقراص الساق والأنسجة الأخرى. ملاحظة: الأنسجة إلا أنه ينبغي أن يظل هو السنانير الفم، وأقراص العين antennal، نصفي الدماغ، والعقدة البطنية (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.1-2.5 مع يرقات إضافية لمدة 15-20 دقيقة. ملاحظة: أقراص تخيلي التي تبقى في المخزن تشريح لفترات أطول من الوقت تميل إلى أن تتحلل وستظهر في نهاية المطاف أنها أقل من عينات مثالية لتصويرها. وهكذا، وبعد مدة أقصاها 20 دقيقة يجب نقل جميع أنسجة تشريح لتثبيتي PLP (انظر أدناه). </li></ol> 3. تثبيت وتلون الأنسجة مع الأجسام المضادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipetman P-200، ونقل الأنسجة تشريح لكوب الساعات التي تحتوي على امتصاص العرق البارد ليسين-بريودات (حزب العمال التقدمي) مثبت. الحد من حجم نقل عازلة تشريح إلى 50 ميكرولتر للحد من التخفيف من حزب العمال التقدمي. تأكد من قطع رأس بشفرة الحلاقة بحيث افتتاح غيض هو كبير بما يكفي لاستيعاب الأنسجة تشريح. باستخدام زوج من ملقط أوإبرة التنغستن تضمن تشريح الأنسجة وغرقت تماما من أجل التثبيت السليم للتحدث. احتضان الأنسجة تشريح في تثبيتي PLP البارد لمدة 45 دقيقة. هذه الحضانة يمكن أن تتم في RT دون الانفعالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipetman P-200، ونقل الأنسجة تشريح لغسل عازلة (RT) باستخدام طرف الأصفر خفض آخر لمدة 45 دقيقة. حجم الحد من حزب العمال التقدمي نقل إلى 50 ميكرولتر للحد من التخفيف من غسل العازلة. ملاحظة: جميع أنسجة تشريح يجب مغمورة تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مجموعات من 20-30 تشريح الأنسجة إلى 1.5 مل microfuge أنبوب. ملاحظة: إذا تم الجمع بين أعداد أكبر من المجمعات القرص العين antennal داخل أنبوب، هناك إمكانية أن الأنسجة في الجزء السفلي من الأنبوب لن يتعرض بشكل صحيح إلى الأجسام المضادة. لأفضل النتائج يجب أن لا يزيد عن 20-30 المجمعات القرص العين antennal الحالي ضمن أنبوب واحد. سوف تشريح الأنسجة تستقر في قاع microfuge أنبوب. الخطوات لذلك، في لاحقة شحد ذاته pipetman لإزالة واستبدال غسل العازلة، حل حظر، والأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غسل العازلة واستبدالها مع 100 ميكرولتر من عرقلة الحل: 10٪ مصل الماعز العادي في غسل العازلة. في احتضان RT مع دوران طيف على أحد كبار المدورة الجدول لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل إزالة الحجب واستبدالها مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية التي تم مخففة بشكل مناسب في 10٪ مصل الماعز العادي. في احتضان RT مع دوران طيف لمدة 16 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجسام المضادة الأولية واستبدالها مع 750 ميكرولتر من غسل العازلة. وضع أنابيب على nutator والسماح لnutate في RT لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: الأجسام المضادة الأولية يمكن حفظ (مخزن في 4 درجات مئوية) وإعادة استخدامها في وقت لاحق. يمكن إعادة استخدام الأجسام المضادة عدة مرات مساعدة في الحد غير محددة وملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سماح رؤساء لتستقر في قاع الأنبوب، ثم إزالة غسل العازلة وإضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية التي تم المخفف مناسب في 10٪ مصل طبيعي. في احتضان RT مع دوران طيف ل2̵1، 4 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حلول الأجسام المضادة الثانوية من الأنسجة واستبدالها مع 500 ميكرولتر من غسل العازلة. تسمح الأنسجة لتستقر في قاع الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام P-200 وتلميح قطع الأصفر، ونقل جميع أنسجة تشريح لمجموعة من غسل العازلة التي تم وضعها على طبق تشريح. في حين الشروع في الخطوة التالية من تشريح ما يرام، فإن احتضان الأنسجة في غسل العازلة. هذا يساعد على إزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة. </li></ol> 4. تشريح الجميلة في العين Antennal القرص مجمعات وتصاعد على الشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام زوج واحد من ملقط لقفل بشرة بواسطة السنانير الفم مع الجانب البطني من مجمع أسفل. مع الزوج الثاني من ملقط إزالة فصوص الدماغ اثنين عن طريق إغلاق ملقط الثانية في الفضاء بين أقراص المخ والعين (الشكل 3، السهم الأحمر) وبسرعة سحب الدماغ بعيدا عن السنانير الفم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الاستمرار في التمسك السنانير الفم، قرصة قبالةالأنسجة أقرب وقت ممكن للاتصال بين قسم antennal من القرص العين antennal والسنانير الفم (الشكل 3، السهم الأزرق). ملاحظة: يجب أن تكون المجمعات القرص العين antennal خالية من جميع الأنسجة (الشكل 1A). تستمر حتى تم تشريح جميع الأنسجة المرجوة المرجوة التي يمكن وضعها على الشرائح. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لعزل الجناح، haltere والساق وأقراص تخيلي التناسلية (الشكل 1B-E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة اثنين من قطع صغيرة من المناديل الورقية (حجم coverslips) حوالي 3 في. بصرف النظر على طبق تشريح. وضع شريحة زجاجية على الطبق - يجب أن قطعتين من المناديل الورقية تكون تحت نهايات الشريحة. هذا سيمنع الشريحة من الالتصاق إلى قاعدة سيليكون للطبق تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام P-20 مع تلميح غير المصقول، إضافة 9 ميكرولتر من وكيل لمكافحة تبييض لمنتصف شريحة المجهر والزجاج. هذا يمنع تبييض الأنسجة عند عرضها مع الفلورسنتالضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام نفس الطرف غير المصقول، وجمع كل أسطوانة العين antennal وإضافتها إلى قطرة مكافحة تبييض كاشف. تقليل كمية من غسل العازلة التي يتم ترحيلها. في محاولة للحد من كمية من غسل العازلة إلى 10 ميكروليتر أو أقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام زوج من ملقط لفصل وانتشرت الأقراص العين antennal داخل قطرة مكافحة تبييض كاشف. تسمح أقراص لاحتضان في مكافحة تبييض كاشف لعدة دقائق. ملاحظة: سوف تتحول الأقراص واضح الأنسجة تمتص كاشف مكافحة التبييض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام فرشاة الرسام غرامة خفض بلطف ساترة على العينة. هذا يمنع تشكيل فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة لعرض أقراص تخيلي العين antennal أو غيرها باستخدام الضوء أو المجهري الفلورسنت. </li></ol>

<ol>
	<li>Weismann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+nachembryonale+entwicklung+der+Musciden+nach+beobachtungen+an+Musca+vomitoria+und+Sarcophaga+carnaria.">Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria.</a> Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 .</li><li>Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaginal disc development. , 747-841 (1993).</li><li>Held, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+Discs:+The+Genetic+and+Cellular+Logic+of+Pattern+Formation.">Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation.</a> Developmental and Cell Biology Series. 39, 460 (2002).</li><li>Miall, L. C., Hammond, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+head+of+the+imago+of+Chironomus.">The development of the head of the imago of Chironomus.</a> Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 .</li><li>Kellog, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+homologies+of+the+mouth+parts+of+insects.">The development and homologies of the mouth parts of insects.</a> Am. Nat. 36, 683-706 (1902).</li><li>Eassa, Y. E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+imaginal+buds+in+the+head+of+Pieris+brassicae+Linn.+(Lepidoptera).">The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera).</a> Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).</li><li>Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage,+growth,+and+determination+in+the+imaginal+leg+discs+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 20, 263-290 (1969).</li><li>Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+analysis+of+development+in+Drosophila+melanogaster:+morphogenesis,+determination+and+growth+in+the+wild+type+antenna.">A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna.</a> Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).</li><li>Anderson, D. T., Counce, S., Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+hemimetabolous+insects.">The development of hemimetabolous insects.</a> Developmental Systems. , 165-242 (1972).</li><li>Anderson, D. T., Counce, S., Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+hemimetabolous+insects.">The development of hemimetabolous insects.</a> Developmental Systems. , 96-163 (1972).</li><li>Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+polyclones+in+insect+development.">Compartments and polyclones in insect development.</a> Science. 189, 340-347 (1975).</li><li>Wieschaus, E., Gehring, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+primordial+disc+cells+in+the+early+embryo+of+Drosophila+melanogaster.">Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).</li><li>Lawrence, P. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+development+of+mesothoracic+compartments+in+Drosophila.+An+analysis+of+cell+lineage+and+fate+mapping+and+an+assessment+of+methods.">The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods.</a> Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).</li><li>Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster.">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+determination+the+beginning+of+eye+development.">Retinal determination the beginning of eye development.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=My+what+big+eyes+you+have:+how+the+Drosophila+retina+grows.">My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows.</a> Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li><li>Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+loci+required+for+follicular+patterning+using+directed+mosaics.">Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics.</a> Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+mushroom+body+is+a+quadruple+structure+of+clonal+units+each+of+which+contains+a+virtually+identical+set+of+neurones+and+glial+cells.">The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells.</a> Development. 124 (4), 761-771 (1997).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li><li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye:+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave.">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li><li>Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TGF+beta+homolog+dpp+and+the+segment+polarity+gene+hedgehog+are+required+for+propagation+of+a+morphogenetic+wave+in+the+Drosophila+retina.">The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina.</a> Cell. 75, 913-926 (1993).</li><li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+segment+polarity+gene+hedgehog+is+required+for+progression+of+the+morphogenetic+furrow+in+the+developing+Drosophila+eye.">The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye.</a> Cell. 75, 927-938 (1993).</li><li>Heberlein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+in+the+Drosophila+eye+coordinated+by+hedgehog.">Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog.</a> Nature. 373, 709-711 (1995).</li><li>Dominguez, M., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+directly+controls+initiation+and+propagation+of+retinal+differentiation+in+the+Drosophila+eye.">Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye.</a> Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).</li><li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Drosophila+eye+development+by+Decapentaplegic.">Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li><li>Borod, E. R., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+regulation+of+decapentaplegic+and+hedgehog+during+the+initiation+of+differentiation+in+the+Drosophila+retina.">Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina.</a> Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).</li><li>Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern-specific+expression+of+the+Drosophila+decapentaplegic+gene+in+imaginal+disks+is+regulated+by+3'+cis-regulatory+elements.">Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements.</a> Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).</li><li>Blackman, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+3'+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic,+a+member+of+the+TGF-b+family+in+Drosophila.">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila.</a> Development. 111, 657-665 (1991).</li><li>Campos, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+the+locus+elav+in+Drosophila+melanogaster:+a+gene+whose+embryonic+expression+is+neural+specific.">Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific.</a> Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).</li><li>Robinow, S., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+locus+elav+of+Drosophila+melanogaster+is+expressed+in+neurons+at+all+developmental+stages.">The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages.</a> Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time.">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).</li><li>Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeo+domain+protein+rough+is+expressed+in+a+subset+of+cells+in+the+developing+Drosophila+eye+where+it+can+specify+photoreceptor+cell+subtype.">The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype.</a> Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).</li><li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atonal,+rough+and+the+resolution+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina.">Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).</li><li>Kumar, J. P., Moses, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+Receptor+and+Notch+signaling+act+upstream+of+Eyeless/Pax6+to+control+eye+specification.">EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification.</a> Cell. 104, 687-697 (2001).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

على الرغم من أن هذا الإجراء قد ركزت بشكل كبير على العزلة ومعالجة لاحقة الأقراص العين antennal، فمن قابلة للتستخدم لعزل وتحليل الجناح، haltere والساق وأقراص التناسلية (الشكل 4). والتعديل الوحيد المطلوب من بروتوكول لعزل هذه الأقراص (على العكس من القرص العين antennal) هو ط?...

لأكثر من قرن من الزمان ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة، فقد كان نظام رئيس الوزراء لدراسة تطوير والسلوك وعلم وظائف الأعضاء. ويمكن تقسيم تطور في الطيران إلى مرحلتين رئيسيتين: الجنينية وبعد الجنينية مع الكثير من أخذ مكان الأخير ضمن أحادي الطبقة الظهارة تسمى أقراص تخيلي 1-3. ونشرت رسومات من أقراص تخيلي لأول مرة في عام 1864 بحلول أغسطس ايزمان كجزء من له دراسة واسعة النطاق على التنمية الحشرات 1. هذه الأقراص تبدأ تنميتها خلال مرحلة التطور الجنيني، ونمط خلال مراحل اليرقات، البقاء على قيد الحياة تحلل النسج الهائل من المراحل المبكرة العذراء، وفي نهاية المطاف تؤدي إلى نسبة عالية من الكبار الهياكل التي تم العثور عليها ضمن الكبار يطير 1-14. خلال نمو اليرقات كل أسطوانة يجعل عدة قرارات حاسمة بشأن مصير والشكل والحجم. ضمن الأعمار اليرقية الأولى والثانية، وكلف الأقراص مع اعتماد مصير الابتدائي، تأسيس العهدهينج حدود المقصورة، واعتماد الشكل الصحيح وتوليد العدد المطلوب من الخلايا 15-16. خلال الطور اليرقي الثالث وأوائل مرحلة ما قبل العذراء، ما زالت أقراص تخيلي لتقسيم ومنقوشة كما تعتمد خلايا مصائرهم الطرفية 16. خلال التاريخ المبكر للذبابة الفاكهة البيولوجيا التطورية، وتمت دراسة أقراص تخيلي تقريبا حصرا في سياق التطور الطبيعي وفي حالات محدودة حيث كانت الخسارة أو الربح من وظيفة متحولة قابلة للحياة. استخدام الأشعة السينية للحث على إعادة التركيب الإنقسامية يسمح للطفرات مميتة ليتم تحليلها في استنساخ خلايا داخل أنسجة اليرقات والكبار. تم تحسين هذه الطريقة من خلال إدخال الأساليب المعدلة وراثيا لتحليل الخسارة وكسب-وظيفة الطفرات في كل أنسجة اليرقات والكبار. عدد الأجسام المضادة، للصحفيين النسخي والفخاخ البروتين لوصف المشهد الجزيئي من النوع البري والأنسجة متحولة هو أيضا CONSTتزايد antly. جعلت استخدام هذه الواسمات الجزيئية لتحليل الخسارة وكسب-وظيفة استنساخ خلية متحولة من الممكن على نحو متزايد لاكتساب فهم في الوقت الحقيقي كيف تنحرف خلايا متحولة من أبناء عمومة النوع البري من خلال التنمية. لاتخاذ صحيح الاستفادة من هذه الأدوات والكواشف فمن الأهمية بمكان أن يكون الإعداد عالية الجودة من أقراص تخيلي التي يمكن مشاهدتها وتصويرها وتحليلها. الهدف من هذا المخطوط هو توفير بروتوكول الأمثل لعزل وإعداد مجمع القرص العين antennal (الشكل 1A). فإنه يمكن أيضا أن تستخدم بنجاح لعزل طائفة واسعة من أقراص إضافية بما في ذلك تلك التي تؤدي إلى الأجنحة، halteres والساقين T1-T3 والأعضاء التناسلية (الشكل 1B-E). هذا الإجراء، مع تعديلات طفيفة، وقد استخدمت لعزل أقراص تخيلي من ذبابة الفاكهة ما يقرب من ثمانين عاما. كما هو موضح أعلاه، حيث يتم التعبير عن معظم الجينات خلال موltiple مراحل التنمية وفي العديد من الأنسجة، وغالبا ما يكون من المستحيل لدراسة الآثار التي المسوخ فارغة لها على العين بأكملها كما يموت الحيوان جيدا قبل مرحلة اليرقات الطور الثالث. حققت أربع طرق دراسة الأنسجة الأكثر تقدما مثل شبكية العين بشكل ملحوظ أكثر لين العريكة. الأول هو طريقة Flippase (FLP) / Flippase إعادة التركيب الهدف (FRT) لتوليد الحيوانات المستنسخة خلية متحولة ضمن نوع الأنسجة البرية خلاف 17-19. في هذه الحالة يتم التعرف على الأنسجة متحولة بسبب عدم وجود علامة بصرية مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ويمكن مقارنة المحيطة البرية نوع الأنسجة التي GFP هو الحاضر (الشكل 2D). والثاني هو الأسلوب &quot;FLP التدريجي&quot; الذي يتم التعبير التحوير في مجموعة من الخلايا 20. في هذه الحالة يتم تحديد استنساخ الخلية وجود GFP وبالمقارنة مع الأنسجة المحيطة النوع البري الذي يفتقر مراسل GFP (الشكل2E). والثالث هو تحليل الفسيفساء مع علامة الخلية كظوم (MARCM) تقنية، الذي يجمع بين عناصر من استنساخ متحولة FLP / FRT وأنظمة التعبير عن FLP من 21. مع هذا الأسلوب التحوير يمكن التعبير ضمن مجموعة من الخلايا التي هي في نفس الوقت متحولة لموضع الجيني الفردي. مثل الحيوانات المستنسخة، FLP بها، ويتم تحديد استنساخ MARCM بحضور GFP وبالمقارنة مع الأنسجة المحيطة النوع البري الذي يفتقر إلى علامة GFP (الشكل 2F). وأخيرا، فإن الجينات ويبني رني يمكن التعبير داخل أنسجة تخيلي تحت سيطرة بنيات محددة المروج-GAL4. هذه الطرق الأربعة قد زادت من الاهتمام في دراسة أقراص تخيلي منذ استنساخ متحولة أو الإفراط في التعبير أو أنماط يمكن مقارنتها مباشرة إلى الأنسجة المجاورة نوع البرية. وقد تم تطوير الطريقة الموضحة في هذا الإجراء حتى أن الباحثين الذين يدرسون تطور آخر الجنينية من أنسجة البالغين في ذبابة الفاكهة،لا سيما تلك المتأتية من القرص العين antennal، سوف تكون قادرة على الحصول على الأنسجة جودة عالية للتحليل. على الرغم من جعلت الباحثين الأفراد تعديلات طفيفة، ظلت جوهر هذا الإجراء (الذي وصفنا هنا) دون تغيير إلى حد كبير. منذ الحصول على الأنسجة جودة عالية أمر بالغ الأهمية لدراسة أقراص تخيلي نأمل أن هذا البروتوكول المكتوبة والفيديو المرافق بمثابة مورد التدريس قيمة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="915">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:165px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:360px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Used to create base for dissection plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pryex Glass Petri Dish 150x20mm</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3160-152CO</td>
			<td>Use the cover for dissection plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#5 Dissecting Forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>525</td>
			<td>Forceps must be kept very sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">9 well watch glass</td>
			<td>Vairous Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for fixation of imaginal disc complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Erlenmeyer Flask</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small Stir Bar</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Small enough to fit into Erlenmeyer Flask</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Conical Tubes</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5ml Microfuge Tubes</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clear or Dark depending upon application</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge Rack</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benchtop Rotator</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>100ul volume should not splatter at low setting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Macron Chemicals</td>
			<td>2-26555-1</td>
			<td>Serves as fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>S-3139</td>
			<td>Used to make dissection and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>71636</td>
			<td>Used to make dissection and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125221000</td>
			<td>Used in the fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Periodate</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>S-1878</td>
			<td>Used in the fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MTX1568-1</td>
			<td>Used to perforate imaginal discs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>EM Science</td>
			<td>SX0593-3</td>
			<td>Used to dissolve paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% Normal Goat Serum`</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>Serves as a blocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary Antibodies</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seondary Antibodies</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Prevents bleaching of samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>48312-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Cover Slips 18x18mm</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe Tissue</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>NA</td>
			<td>Prevents Glass slides from adhering to silicone base</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Panit Brush 000</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use to gently lower coverslip on to samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster

جزء كبير من التنمية في مرحلة ما بعد الجنينية في ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، يحدث ضمن مجموعة من الهياكل التي تشبه الكيس تسمى أقراص تخيلي. هذه الأقراص تؤدي إلى نسبة عالية من الكبار الهياكل التي تم العثور عليها داخل ذبابة الكبار. نحن هنا وصف البروتوكول الذي تم الأمثل لاستعادة هذه الأقراص وإعدادهم للتحليل مع الأجسام المضادة للصحفيين النسخي والفخاخ البروتين. هو الانسب هذا الإجراء لأنسجة رقيقة مثل أقراص تخيلي، ولكن يمكن تعديلها بسهولة للاستخدام مع الأنسجة سمكا مثل اليرقات الدماغ والكبار المبيض. سوف بروتوكول مكتوبة والفيديو المصاحبة توجيه القارئ / المشاهد من خلال تشريح يرقات الطور الثالث، تثبيت الأنسجة، والعلاج من أقراص تخيلي مع الأجسام المضادة. بروتوكول يمكن استخدامها لتشريح أقراص تخيلي من الأصغر سنا يرقات الطور الأول والثاني كذلك. وميزة هذا البروتوكول هو أنه قصير نسبيا ولها أن تكونأون الأمثل للحفاظ جودة عالية من الأنسجة تشريح. ميزة أخرى هي أن الإجراء التثبيت أن يعمل يعمل بشكل جيد مع العدد الهائل من الأجسام المضادة التي تعترف البروتينات ذبابة الفاكهة. في تجربتنا، وهناك عدد قليل جدا من الأجسام المضادة الحساسة التي لا تعمل بشكل جيد مع هذا الإجراء. في هذه الحالات، فإن العلاج يبدو أن لاستخدام كوكتيل تثبيت البديل مع الاستمرار في اتباع المبادئ التوجيهية التي وضعناها عليها للخطوات تشريح وحضانات الأجسام المضادة.

طريقة الموضح أعلاه موثوق تنتج مواد ذات جودة عالية للتحليل مع تحقيقات في الموقع، للصحفيين النسخي، والفخاخ البروتين والأجسام المضادة. في الشكل 1 نعرض العين الهوائي، والأعضاء التناسلية، الجناح، haltere والساق الأقراص التي يتم استردادها بشكل روتيني مع هذا ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster at JoVE.com

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

تشريح والمناعية من تخيلي أقراص من<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

26.3K Views.  Indiana University. The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Video: Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

تشريح الجهاز العصبي المركزي اليرقات في Melanogaster ذبابة الفاكهة

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

تشريح أقراص تخيلي من يرقات ذبابة الفاكهة طور مرحلي 3

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

ذبابة الفاكهة تشريح اليرقات NMJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

يعيش التصوير للهجرة الخلايا الدبقية في القرص العين تخيلي ذبابة الفاكهة

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

تشريح Oenocytes من الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

تشريح وتلون ذبابة الفاكهة اليرقات المبايض

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

عزلة ذبابة الفاكهة السوداء البطن الخصيات

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

قياس عمر في<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

تشريح وتركيب<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء أقراص العين

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...