Name: dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster
Uploaded: 2014-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster at JoVE.com

Biz JPK orijinal hayali disk diseksiyonu işlemini öğretirken Donald hazır ve Kevin Musa&#39;yı teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, Şekil 1B genital disk ve Şekil 3 Şekil 2A Brandon Weasner, göz diski Bonnie Weasner ederiz, sinek lekelere Bloomington Drosophila Stok Merkezi ve antikor Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası. CMS Sağlık (NIH) GCMS Eğitim Grant National Institutes (T32-GM007757), Frank W. Putnam Araştırma Bursu ve Robert Briggs Araştırma Bursu bir nakit tarafından desteklenmiştir. JPK Ulusal Göz Enstitüsü bir hibe ile desteklenen (R01 EY014863)

Larva 1. Hazırlık <ol><li> Diseksiyon tamponu ile, bir 35 mm Petri kabı doldurun. </li><li> Petri kabındaki larva yerleştirin ve onları bir kaç dakika (kendi kendini temizleme adım) için etrafında yüzmek için izin verir. </li><li> Bir silikon bazlı diseksiyon plaka üzerinde diseksiyon tampon bir havuza larva transferi. Bu havuz, levhanın bir kenarına olmalıdır. Diseksiyon levha, cam bir Petri kabı içinde dökülmüş ve sertleştirilmiş olan bir silikon çözelti oluşur. </li><li> Bir pastör pipeti kullanılarak-, diseksiyon plaka ortasında tahlil tamponuna büyük bir havuz yerleştirin. </li><li> 5. forseps kullanarak, diseksiyon tampon büyük havuza küçük havuzda tek temizlenmiş larva transferi. </li></ol> Larva 2. Kaba Diseksiyon <ol><li> Larva diseksiyonu tampon büyük havuzun içinde hala ise forseps ile larva toka. Forseps ve diğer çift Anim tutmak için kullanılır ise forseps bir çift ağız kanca kapmak için kullanılmalıdırdiğerleri hala (1/3 vücut uzunlukta hafifçe larva kapmak). </li><li> Hızla forseps ikinci çifti ile uzak vücudun geri kalanını çekerken ağız kanca yakın manikür içeren forseps çifti sakinleştirmeye tutun. </li><li> Larva parçalıyorlar başlar zaman gerginlik hafif bir serbest hissedeceksiniz. Forseps larva bırakın ve dışarı dökmek için larva &quot;cesaret&quot; için izin verir. Bu, normal konformasyonda kalması için hayali diskler sağlar ve deforme edilmesini engeller. </li><li> Forseps bir çift ile yerde larva ön ucunu tutmak için tekrar ağız kanca kavramak. Forseps kullanılarak diğer çift de dahil olmak üzere, iç bağırsakta larvaların 2/3 alt çıkarın. Not: ağız kancaları, göz antennal diskleri, beyin hemisfer, ventral ganglion, tükürük bezleri, bazı bacak diskler içeren karmaşık ve örten manikür kalacaktır. </li><li> Forseps bir çift ile hafifçe örten manikür, tükürük bezleri, bacak diskleri ve kaldırmakdiğer doku. Not: Yalnızca ağız kancalar, göz antennal diskler, beyin hemisfer ise kalmalıdır doku ve ventral ganglion (Şekil 3). </li><li> Tekrar 15-20 dakika için ek larva ile 2,1-2,5 adımları. Not: uzun süre için diseksiyon tampon kalır hayali diskler aşağılamak eğilimindedir ve sonuçta çektirmek için ideal bir numunelere göre daha az gibi görünecektir. Böylece, tüm kesilmiş dokuları PLP sabitleyici aktarılması gerekmektedir 20 dakika sonrasında en (aşağıya bakınız). </li></ol> Antikorlar ile 3. Fiksasyon ve Doku Boyama <ol><li> P-200 Pipetman kullanarak, soğuk Paraformaldehit-Lizin-Periyodat (HUA) fiksatif içeren bir saat cam disseke dokuların aktarın. 50 ul transfer diseksiyon tampon sınırı hacmi PLP&#39;nin seyreltme en aza indirmek için. Ucu açılma disseke dokuları barındıracak kadar büyük olduğunu böylece bir jilet ile ucu kesmek için emin olun. Bir çift forseps kullanılması veyatungsten iğne disseke dokuların tamamen doğru tespit gerçekleşmesi için batık emin olun. 45 dakika boyunca soğuk HUA sabitleyici disseke dokuları inkübe edin. Bu inkübasyon ajitasyon olmadan oda ısısında gerçekleşebilir. </li><li> P-200 Pipetman kullanarak, 45 dakika boyunca bir kesim sarı ucu kullanılarak yıkama tamponu (RT) kesilmiş dokuları aktarın. 50 ul transfer PLP sınırı hacim yıkama tamponu ile seyreltme en aza indirir. Not: Tüm disseke dokuların tamamen sular altında olmalıdır. </li><li> 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp disseke doku 20-30 setleri aktarın. Not: Göz antennal disk kompleksleri daha çok sayıda boru içinde karıştırılması durumunda, borunun altındaki doku antikorlara uygun maruz kalmayacak bir olasılığı vardır. Optimal sonuçlar için fazla 20-30 göz antennal disk kompleksleri tek bir tüp içinde mevcut olmalıdır. Disseke doku mikrofuge&#39;ye tüpün dibine çökecektir. Bu yüzden, daha sonraki adımlar uçıkarın ve yıkama tamponu engelleme çözeltisi ve antikor yerine bir Pipetman se. </li><li> Yıkama tamponunu çıkarın ve bloklama çözeltisi 100 ul ile değiştirin: yıkama tamponu içinde% 10 normal keçi serumu. 10 dakika boyunca masa üstü bir karıştırıcı üzerine hafif bir döndürme ile oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Bloke çözeltisini çıkarın ve uygun bir şekilde,% 10 normal keçi serumu içinde seyreltilmiş olan birincil antikor 100 ul ile değiştirin. 16 saat süre ile hafif bir dönme ile oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Primer antikor çıkarın ve yıkama tamponu 750 ul ile değiştirin. Bir nutator tüpleri ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında nutate sağlar. Not: primer antikor (4 ° C&#39;de mağaza) kaydedilir ve daha sonra yeniden kullanılabilir. Antikorlardır birden çok kez yeniden kullanma spesifik olmayan bağlanma azaltılmasında yardımcı olabilir. </li><li> Kafaları, daha sonra borunun dibe yıkama tamponunu çıkarın ve uygun bir şekilde,% 10 normal serum içinde seyreltilmiş olan ikincil antikor, 100 ul ilave izin verin. Yumuşak devir için RT&#39;de inkübe 2̵1, 4 sa. </li><li> Dokudan ikincil antikor çözüm çıkarın ve yıkama tamponu ile 500 ul ile değiştirin. Doku tüpün dibine çökme eğilimi göstermesine izin verin. </li><li> P-200 ve bir kesme sarı ucu kullanarak, kesme tabağına yerleştirilmiş olan yıkama tamponu ile bir havuza tüm parçalara dokuları aktarın. Ince diseksiyon sonraki adıma geçmeden ederken, doku yıkama tamponunda inkübe olacak. Bu aşırı ikincil antikorlar kaldırmak için yardımcı olur. </li></ol> 4. Göz-Antennal Disk Kompleksleri Güzel Diseksiyon ve Slaytlar üzerine Montaj <ol><li> Aşağı bakacak kompleksinin ventral yüzü ile ağız kanca tarafından manikür kavrayabilirdim için forseps bir çift kullanın. Forseps ikinci bir çift göz ve beyin diskler arasındaki boşlukta (Şekil 3, kırmızı ok) ikinci forseps kapanış ve hızla ağzına kanca uzak beyin çekerek iki beyin lobu çıkarın. </li><li> Ağız kanca tutunmaya devam ederken, çimdikgöz antennal diskin antennal bölümü ile ağız kanca (Şekil 3, mavi ok) arasındaki bağlantının mümkün olduğu kadar yakın bir doku. Not: göz antennal disk kompleksleri tüm doku (Şekil 1A) ücretsiz olmalıdır. Slaytlar üzerine yerleştirilebilir istenen istenen tüm doku disseke olmuştur kadar devam edin. Bu protokol, kanat, haltere, bacak ve genital hayali diskleri (Şekil 1B-D) izole etmek için adapte edilebilir. </li><li> Kağıt mendil iki küçük parça (lamelleri boyut) yaklaşık 3 ekleyin. Ayrı diseksiyon çanak. Kabı üzerine bir cam slayt yerleştirin - ince kağıdın iki adet sürgünün uçları altında olmalıdır. Bu kesme çanak silikon tabanına yapışmasını slayt önleyecektir. </li><li> Kesilmemiş bir ucu olan bir P-20 kullanılarak cam mikroskop slayt ortasına da bir ağartma karşıtı maddenin 9 ul ekleyin. Floresan ile bakıldığında bu dokunun ağartma önlerışık. </li><li> Aynı kesilmemiş ucu kullanarak, tüm göz-antennal diskleri toplamak ve anti-ağartma reaktif damla ekleyebilirsiniz. Işlemine tabi tutulan, yıkama tampon miktarını en aza indirir. 10 ul veya daha az yıkama tampon miktarını sınırlamaya çalışın. </li><li> Ayırmak ve anti-ağartma reaktif damla içindeki göz antennal diskleri yaymak için bir çift forseps kullanın. Diskler birçok dakika için ağartma karşıtı ayraç inkübe izin verin. Not: doku ağartma karşıtı ayraç emdiğinde diskler berrak dönecek. </li><li> Ince bir fırça kullanarak hafifçe numune üzerine bir lamel indirin. Bu hava kabarcıklarının oluşumunu engeller. </li><li> Mağaza ışık veya floresan mikroskopi kullanılarak göz antennal veya başka bir hayali diskleri görüntülemek için hazır olana kadar -20 ° C&#39;de kayar. </li></ol>

<ol>
	<li>Weismann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+nachembryonale+entwicklung+der+Musciden+nach+beobachtungen+an+Musca+vomitoria+und+Sarcophaga+carnaria.">Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria.</a> Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 .</li><li>Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaginal disc development. , 747-841 (1993).</li><li>Held, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+Discs:+The+Genetic+and+Cellular+Logic+of+Pattern+Formation.">Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation.</a> Developmental and Cell Biology Series. 39, 460 (2002).</li><li>Miall, L. C., Hammond, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+head+of+the+imago+of+Chironomus.">The development of the head of the imago of Chironomus.</a> Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 .</li><li>Kellog, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+homologies+of+the+mouth+parts+of+insects.">The development and homologies of the mouth parts of insects.</a> Am. Nat. 36, 683-706 (1902).</li><li>Eassa, Y. E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+imaginal+buds+in+the+head+of+Pieris+brassicae+Linn.+(Lepidoptera).">The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera).</a> Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).</li><li>Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage,+growth,+and+determination+in+the+imaginal+leg+discs+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 20, 263-290 (1969).</li><li>Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+analysis+of+development+in+Drosophila+melanogaster:+morphogenesis,+determination+and+growth+in+the+wild+type+antenna.">A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna.</a> Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).</li><li>Anderson, D. T., Counce, S., Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+hemimetabolous+insects.">The development of hemimetabolous insects.</a> Developmental Systems. , 165-242 (1972).</li><li>Anderson, D. T., Counce, S., Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+hemimetabolous+insects.">The development of hemimetabolous insects.</a> Developmental Systems. , 96-163 (1972).</li><li>Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+polyclones+in+insect+development.">Compartments and polyclones in insect development.</a> Science. 189, 340-347 (1975).</li><li>Wieschaus, E., Gehring, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+primordial+disc+cells+in+the+early+embryo+of+Drosophila+melanogaster.">Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).</li><li>Lawrence, P. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+development+of+mesothoracic+compartments+in+Drosophila.+An+analysis+of+cell+lineage+and+fate+mapping+and+an+assessment+of+methods.">The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods.</a> Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).</li><li>Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster.">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+determination+the+beginning+of+eye+development.">Retinal determination the beginning of eye development.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=My+what+big+eyes+you+have:+how+the+Drosophila+retina+grows.">My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows.</a> Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li><li>Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+loci+required+for+follicular+patterning+using+directed+mosaics.">Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics.</a> Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+mushroom+body+is+a+quadruple+structure+of+clonal+units+each+of+which+contains+a+virtually+identical+set+of+neurones+and+glial+cells.">The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells.</a> Development. 124 (4), 761-771 (1997).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li><li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye:+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave.">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li><li>Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TGF+beta+homolog+dpp+and+the+segment+polarity+gene+hedgehog+are+required+for+propagation+of+a+morphogenetic+wave+in+the+Drosophila+retina.">The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina.</a> Cell. 75, 913-926 (1993).</li><li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+segment+polarity+gene+hedgehog+is+required+for+progression+of+the+morphogenetic+furrow+in+the+developing+Drosophila+eye.">The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye.</a> Cell. 75, 927-938 (1993).</li><li>Heberlein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+in+the+Drosophila+eye+coordinated+by+hedgehog.">Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog.</a> Nature. 373, 709-711 (1995).</li><li>Dominguez, M., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+directly+controls+initiation+and+propagation+of+retinal+differentiation+in+the+Drosophila+eye.">Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye.</a> Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).</li><li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Drosophila+eye+development+by+Decapentaplegic.">Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li><li>Borod, E. R., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+regulation+of+decapentaplegic+and+hedgehog+during+the+initiation+of+differentiation+in+the+Drosophila+retina.">Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina.</a> Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).</li><li>Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern-specific+expression+of+the+Drosophila+decapentaplegic+gene+in+imaginal+disks+is+regulated+by+3'+cis-regulatory+elements.">Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements.</a> Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).</li><li>Blackman, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+3'+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic,+a+member+of+the+TGF-b+family+in+Drosophila.">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila.</a> Development. 111, 657-665 (1991).</li><li>Campos, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+the+locus+elav+in+Drosophila+melanogaster:+a+gene+whose+embryonic+expression+is+neural+specific.">Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific.</a> Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).</li><li>Robinow, S., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+locus+elav+of+Drosophila+melanogaster+is+expressed+in+neurons+at+all+developmental+stages.">The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages.</a> Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time.">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).</li><li>Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeo+domain+protein+rough+is+expressed+in+a+subset+of+cells+in+the+developing+Drosophila+eye+where+it+can+specify+photoreceptor+cell+subtype.">The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype.</a> Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).</li><li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atonal,+rough+and+the+resolution+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina.">Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).</li><li>Kumar, J. P., Moses, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+Receptor+and+Notch+signaling+act+upstream+of+Eyeless/Pax6+to+control+eye+specification.">EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification.</a> Cell. 104, 687-697 (2001).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu prosedür, büyük ölçüde izole edilmesi ve göz antennal diskler daha ilerideki muamelesi odaklanmış olmakla beraber, bu izole etmek ve kanat, haltere, bacak ve genital diskleri (Şekil 4) analiz etmek için kullanılan elverişlidir. (Göz antennal diske karşı), bu diskleri izole edilmesi için protokol tek gerekli modifikasyon kaba Diseksiyon (protokol, Bölüm 2) &#39;nin bir yöntemdir. İlk göğüs ayağı (T1), bir çift larva anterior bulunur ve göz antennal disk izolasyonu için pro...

Yüzyılı aşkın bir meyve sineği Drosophila melanogaster için, geliştirme, davranış ve fizyolojisini incelemek için önde gelen bir sistem olmuştur. Ikincisi alma yere kadar olan embriyonik ve post-embriyonik tek tabaka epitellerinden içinde hayali diskler 1-3 seslendi: sinek Kalkınma iki geniş aşamadan ayrılabilir. Hayali diskler çizimleri ilk böcek gelişimine 1 onun geniş monografi parçası olarak Ağustos Weismann tarafından 1864 yılında yayımlandı. Bu diskler 1-14 yetişkin sinek içinde bulunan ergin yapılara yüksek bir yüzdesine yol açan nihai olarak ilk pupa safhalarının yoğun doku çözülmesi hayatta ve larva aşamalarında desenli embriyojenez sırasında gelişme başlar. Larva gelişimi sırasında her bir disk kaderi, şekli ve büyüklüğü ile ilgili pek çok kritik kararlar alır. Birinci ve ikinci larva instars içinde, diskler, birincil kaderi benimseyerek establis görevliDoğru şekli alarak ve hücrelerin 15-16 arasında gerekli sayıda üretilmesi, bölme sınırları hing. Üçüncü larva ve erken pre-pupa aşamasında, hayali diskler bölünmeye devam ve hücreleri terminali kaderlerini 16 evlat gibi desenli. Drosophila gelişimsel biyoloji erken tarih boyunca, hayali diskler normal gelişim bağlamında ve bir kazanç ya da kayıp fonksiyon-mutant canlı olduğu hangi sınırlı durumlarda neredeyse sadece çalışıldı. X-ışınlarının kullanımı ölümcül mutasyonlar izin mitotik rekombinasyon larva ve yetişkin dokularda hücre klonlarının analiz edilecek ikna etmek. Bu yöntem larva ve yetişkin dokularda hem de mutasyonlar kaybını analiz etmek ve kazanç fonksiyon-transgenik yöntemler giriş tarafından geliştirilmiştir. Vahşi tipli ve mutant Dokuların moleküller manzara tanımlamak için antikorlar, transkripsiyonel raportörler, ve protein tuzaklar sayısı da const &#39;tırantly büyüyen. Mutant hücre klonları kaybını analiz etmek ve kazanç fonksiyon-bu moleküler işaretlerini kullanarak giderek mümkün mutant hücreler gelişim sırasında, kendi vahşi tip kuzenleri sapan nasıl bir gerçek zamanlı anlayış kazanmak için yaptı. Doğru bu araçları ve reaktiflerin yararlanmak için bu inceledi fotoğraflandı ve analiz edilebilir hayali diskler yüksek kaliteli hazırlıklarını kritik öneme sahiptir. Bu yazının amacı göz antennal diski kompleksinin (Şekil 1A) &#39;nin izolasyonu ve hazırlanması için optimize edilmiş bir protokol sağlamaktır. Ayrıca, başarılı bir şekilde kanatlar, halteres, T1-T3 bacak ve cinsel organların (Şekil 1B-D) yol da dahil olmak üzere ek disklerin çok çeşitli izole etmek için kullanılabilir. Minör modifikasyonlarla bu prosedür, yaklaşık seksen yıldır Drosophila &#39;dan gelen hayali diskleri izole etmek için kullanılmıştır. En genler mu sırasında ifade edildiği gibi, yukarıda tarif edilengelişme ve dokuların çok sayıda aşamaları ltiple, bu hayvan Üçüncü dönem larva aşamasından önce ölür null mutantlar tüm göz olması etkilerini incelemek imkansızdır. Dört yöntemler, önemli ölçüde daha uysal retina gibi daha gelişmiş dokuların çalışma yaptık. Birinci bir başka vahşi tip doku 17-19 olan mutant hücre klonları jenere arasında Flippase (FLP) / Flippase rekombinasyonu hedeflemek (STT) yöntemidir. Bu durumda, mutasyona uğramış doku, yeşil flüoresan protein (GFP) gibi bir görsel işaretin olmaması ile tanımlanır ve GFP mevcut olduğu çevre vahşi tip doku (Şekil 2B) mukayese edilebilir. İkinci bir transgen hücrelerinin 20 bir popülasyonunda ifade edildiği &quot;Flp üzerinden&quot; yöntemidir. Bu durumda, hücre klonları, GFP raportör yoksun çevresindeki yabani tip doku (Şekil GFP varlığı ile tanımlanan ve karşılaştırılmıştır2E). Üçüncü FLP / FRT mutant klon ve bdp-dışarı ekspresyon sistemleri 21 unsurlarını birleştiren bir Baskılanabilir Hücre Marker (MARCM) tekniği ile Mozaik Analizi&#39;dir. Bu yöntem ile, bir transgen, aynı anda tek bir genetik lokus için mutant bir hücre popülasyonu içinde ifade edilebilir. Flp üzerinden klonları gibi, klonlar MARCM GFP varlığı ile tanımlanan ve GFP işaretleyici (Şekil 2F) yoksun çevreleyen vahşi tip doku ile karşılaştırılır. Ve son olarak, genler ve RNAi yapıları, GAL4 spesifik promotör-yapılarının kontrol altında hayali dokularda ifade edilebilir. Mutant veya aşırı ifadesi ya da klonlar desenler doğrudan bitişik vahşi tip dokuya göre olabilir çünkü Bu dört yöntem hayali diskleri okuyan ilgiyi artırmıştır. Bu prosedürde açıklanan gibi bir yöntem geliştirilmiştir ve böylece Drosophila yetişkin dokuların sonrası embriyo gelişimini çalışan araştırmacılar,Özellikle göz-antennal diskten türetilenler, analiz için yüksek kaliteli doku elde etmek mümkün olacaktır. Bireysel araştırmacılar küçük değişiklikler yapmış olsa da, bu prosedüre (biz burada açıklamak olan) çekirdek büyük ölçüde değişmeden kalmıştır. Yüksek kaliteli dokusu elde biz bu yazılı bir protokol ve beraberindeki görüntü değerli bir öğretim kaynağı olarak hizmet umuyoruz hayali disklerin çalışmaya kritik olduğundan.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5 KG</td><td>Used to create base for dissection plate</td></tr><tr><td>Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm</td><td>Dow Corning</td><td>3160-152CO</td><td>Use the cover for dissection plate</td></tr><tr><td>#5 Dissecting Forceps</td><td>Ted Pella</td><td>525</td><td>Forceps must be kept very sharp</td></tr><tr><td>9 well watch glass</td><td>Vairous Vendors</td><td></td><td>Used for fixation of imaginal disc complexes</td></tr><tr><td>50 ml Erlenmeyer Flask</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small Stir Bar</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Small enough to fit into Erlenmeyer Flask</td></tr><tr><td>50 ml Conical Tubes</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microfuge Tubes</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Clear or Dark depending upon application</td></tr><tr><td>Microfuge Rack</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Rotator</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>100 &amp;#956;l volume should not splatter at low setting</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Macron Chemicals</td><td>2-26555-1</td><td>Serves as fixative</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-3139</td><td>Used to make dissection and wash buffers</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>71636</td><td>Used to make dissection and wash buffers</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Acros Organics</td><td>125221000</td><td>Used in the fixative solution</td></tr><tr><td>Sodium Periodate</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-1878</td><td>Used in the fixative solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>MTX1568-1</td><td>Used to perforate imaginal discs</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>EM Science</td><td>SX0593-3</td><td>Used to dissolve paraformaldehyde</td></tr><tr><td>100% Normal Goat Serum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>Serves as a blocking solution</td></tr><tr><td>Primary Antibodies</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td></tr><tr><td>Secondary Antibodies</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Molecular Probes</td><td>H-1000</td><td>Prevents bleaching of samples</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fischer Scientific</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>Glass Cover Slips 18 x 18 mm</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe Tissue</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Prevents Glass slides from adhering to silicone base</td></tr><tr><td>Panit Brush 000</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Use to gently lower coverslip on to samples</td></tr></tbody></table>

dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster

Post-embriyonik meyve sineğinin gelişimi, Drosophila melanogaster önemli bir kısmı, hayali olarak adlandırılan diskler kese gibi yapıların bir dizi içinde yer alır. Bu diskler, yetişkin sinek içinde bulunan ergin yapılara yüksek bir yüzdesine yol açar. Burada bu diskleri kurtarmak ve antikorlar, transkripsiyon gazetecilere ve protein tuzakları ile analiz için onları hazırlamak için optimize edilmiş bir protokol açıklar. Bu işlem en iyi hayali diskler gibi ince dokular için uygundur, ancak kolay gibi, larva ve yetişkin beyin yumurtalık kalın dokuları ile kullanılmak üzere modifiye edilebilir. Yazılı bir protokol ve beraberindeki Video üçüncü larva, doku fiksasyonu ve antikorlar ile hayali diskler tedavisi diseksiyon ile okuyucu / izleyiciye rehberlik edecektir. Protokol da daha küçük olan, birinci ve ikinci instar larvalarından hayali diskleri incelemek için kullanılabilir. Bu protokolün avantajı nispeten kısa olduğunu ve olması vardırdisseke doku yüksek kalite korunması için optimize tr. Diğer bir avantaj kullanıldığı sabitleme işlemi, Drosophila proteinleri tanıyan antikorların ezici sayı ile çalışır. Bizim tecrübelerimize göre, bu prosedürü ile iyi çalışmaz duyarlı antikorların çok küçük bir sayı vardır. Bu durumlarda, çare biz diseksiyon adımlar ve antikor inkübasyonlarının için belirlenen adres yönergeleri takip devam ederken alternatif bir sabitleme kokteyl kullanmak gibi görünüyor.

Güvenilir bir şekilde yukarıda tarif edildiği gibi bir yöntem, in situ probları, transkripsiyonel raportörler, protein tuzakları ve antikorlarda analiz için yüksek kaliteli malzeme üretmektedir. Şekil 1 de rutin olarak bu yöntemle iyileşti göz anteni, genital, kanat, haltere ve bacak diskleri görüntüler. Bu diskler, F-aktine bağlanan ve bu nedenle de her bir hücreyi ortaya koyan bir falloidin-konjüge edilmiş fluorophore ile tedavi edilmiştir. Doku daha sonra düz...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster at JoVE.com

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

26.6K Görüntüleme.  Indiana University. The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Video: Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biyoloji

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

3. Instar Drosophila Larva hayali Disklerin Diseksiyon

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Nörobilim

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Gelişim Biyolojisi

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Larva, Pupa ve Erişkin diseksiyonu ve İmmünohistokimya<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinaları

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries made using this system have taken advantage of the spatiotemporal nature of photoreceptor differentiation in the developing eye imaginal disc. To use this system it is first necessary for the researcher to learn to identify and dissect the eye disc. We describe a novel RFP reporter to aid in the identification of the eye disc and the visualization of specific cell types in the developing eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc from third instar larvae and describe how the eye-RFP reporter can aid in this dissection. This eye-RFP reporter is only expressed in the eye and can be visualized using fluorescence microscopy either in live tissue or after fixation without the need for signal amplification. We also show how this reporter can be used to identify specific cells types within the eye disc. This protocol and the use of the eye-RFP reporter will aid researchers using the Drosophila eye to address fundamentally important biological questions.

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

We describe a novel red fluorescent protein (RFP) reporter that is expressed specifically in the Drosophila eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc and how this reporter can be used to aid in the dissection and identification of specific cell types in the developing eye.

Göz hayali Disk Görselleştirme Yardım Roman RFP Reporter Drosophila</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the developmental mechanisms that generate neural diversity and drive circuit assembly. Given its complex three-dimensional organization, analysis of the optic lobe requires that one understand how its adult neuropils and larval progenitors are positioned relative to each other and the central brain. Here, we describe a protocol for the dissection, immunostaining and mounting of larval and adult brains for optic lobe imaging. Special emphasis is placed on the relationship between mounting orientation and the spatial organization of the optic lobe. We describe three mounting strategies in the larva (anterior, posterior and lateral) and three in the adult (anterior, posterior and horizontal), each of which provide an ideal imaging angle for a distinct optic lobe structure.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

This protocol describes three steps to prepare larval and adult Drosophila optic lobes for imaging: 1) brain dissections, 2) immunohistochemistry and 3) mounting. Emphasis is placed on step 3, as distinct mounting orientations are required to visualize specific optic lobe structures.&#160;

Optik lob görselleştirmesi için larva ve erişkin drosophila beyinlerinin diseksiyonu, immünohistokimyası ve montajı

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Diseksiyon ve montajı<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz Diskler

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler