Wir möchten Donald Ready und Kevin Moses für den Unterricht JPK die ursprüngliche Imaginalscheibe Dissektion Verfahren danken. Wir danken auch Bonnie Weasner für die Genitalscheibe in 1B und dem Auge Scheibe in 2A, Brandon Weasner für Abbildung 3 ist die Bloomington Drosophila Stock Center für Fliegen Flecken und die Entwicklungsstudien Hybridoma Bank für Antikörper. CMS wurde von einem Stipendium der National Institutes of Health (NIH) GCMS Trainings Grant (T32-GM007757), die Frank W. Putnam-Forschungsstipendium, und der Robert Briggs-Forschungsstipendium unterstützt. JPK wird durch einen Zuschuss aus dem National Eye Institute unterstützt (R01 EY014863)

1. Herstellung von Larven <ol><li> Füllen Sie eine 35 mm Petrischale mit Dissektion Puffer. </li><li> Zeigen Larven in Petrischale und es ihnen ermöglichen, um für ein paar Minuten (Selbstreinigungsschritt) zu schwimmen. </li><li> Übertragen Larven zu einem Pool von Präparation Puffer auf Silikonbasis Schneideplatte. Dieser Pool ist an einer Kante der Platte ist. Die Schneideplatte aus einer Silikonlösung, die gegossen wurde und in einer Glaspetrischale ausgehärtet. </li><li> Mit einer Pasteurpipette, legen Sie einen größeren Pool von Dissektion Puffer in der Mitte der Platte Dissektion. </li><li> Mit # 5 Zangen, übertragen eine einzelne gereinigt Larve aus dem kleinen Pool in den größeren Pool von Dissektion Puffer. </li></ol> 2. Grob Dissektion der Larven <ol><li> Während die Larve noch im großen Pool von Dissektion Puffer umklammern die Larve mit der Zange. Eine Pinzette sollte verwendet werden, um die Mundhaken greifen werden, während das andere Paar der Pinzette wird die anim haltenal noch (greifen die Larve sanft 03.01 Körperlänge). </li><li> Hold Steady die Zange, die die Oberhaut in der Nähe der Mundhaken, während schnell Ziehen der Rest des Körpers weg mit dem zweiten Paar der Pinzette. </li><li> Wenn die Larve beginnt zu zerreißen Sie eine leichte Freisetzung in Spannung zu spüren. Lassen Sie die Larve aus der Zange und damit für die &quot;Innereien&quot; der Larve zu verschütten. Dies ermöglicht die Imaginalscheiben in ihre normale Konformation bleiben und verhindert, dass sie verformt wird. </li><li> Mit einer Pinzette fassen die Mundhaken wieder auf das vordere Ende der Larve in Position zu halten. Mit der anderen Pinzette entfernen Sie die unteren zwei Drittel der Larven einschließlich der inneren Mut. Hinweis: ein Komplex der Mundhaken, die Augenantennenscheiben, Gehirnhälften, ventralen Ganglion, die Speicheldrüsen, einige Discs mit Bein, und die darüber liegende Oberhaut wird bleiben. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen darüberliegenden Oberhaut, der Speicheldrüsen, Beinscheiben undandere Gewebe. Hinweis: nur Gewebe, die bleiben, ist die Mundhaken, Augenantennenscheiben, Gehirnhälften sollte, und ventralen Ganglion (Abbildung 3). </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.5 mit zusätzlichen Larven für 15-20 min. Hinweis: Imaginalscheiben in Präparation Puffer für längere Zeit bleiben neigen zum Abbau und letztendlich als weniger ideal Proben fotografiert werden angezeigt. So, nach maximal 20 min alle seziert Gewebe sollte der PLP Fixiermittel übertragen werden (siehe unten). </li></ol> 3. Fixierung und Färbung von Gewebe mit Antikörper <ol><li> Mit Hilfe eines P-200 Pipetman, übertragen Sie die sezierten Gewebe auf ein Uhrglas mit kaltem Paraformaldehyd-Lysin-Periodatoxidation (PLP) Fixiermittel. Limit Volumen der übertragenen Dissektion Puffer zu 50 ul der Verdünnung von PLP zu minimieren. Achten Sie darauf, die Spitze mit einer Rasierklinge geschnitten, so dass die Spitze Öffnung groß genug, um die Gewebe seziert aufzunehmen. Verwendung einer Pinzette odereine Wolfram-Nadel sicherzustellen, dass die sezierten Gewebe völlig in Ordnung für die richtige Fixierung auftreten getaucht. Inkubieren seziert Gewebe in kaltem PLP Fixiermittel für 45 min. Diese Inkubation Ort bei RT ohne Rühren erfolgen. </li><li> Mit Hilfe eines P-200 Pipetman, übertragen Sie die sezierten Gewebe Puffer waschen (RT) mit einem anderen geschnitten gelben Spitze für 45 min. Grenze Volumen übertragen PLP zu 50 ul der Verdünnung des Waschpuffers zu minimieren. Hinweis: Alle seziert Gewebe sollte vollständig eingetaucht werden. </li><li> Übertragen 20-30 Sätze von seziert Gewebe in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Wenn eine größere Anzahl von Blickantennenscheibe Komplexe werden im Rohr kombiniert werden, gibt es eine Möglichkeit, dass das Gewebe an der Unterseite des Rohres nicht richtig an die Antikörper ausgesetzt werden. Für optimale Ergebnisse sollte nicht mehr als 20-30 Augenantennenscheibe Komplexe in einem einzigen Rohr vorhanden sein. Die sezierten Gewebe werden auf dem Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu regeln. Daher wird in den nachfolgenden Schritten uSE Pipetman zu entfernen und zu ersetzen Waschpuffer, Blocklösung und Antikörper. </li><li> Waschpuffer zu entfernen und ersetzen mit 100 l Blocking-Lösung: 10% normalem Ziegenserum in Waschpuffer. Inkubation bei RT unter leichtem Drehen auf einer Tischdreheinrichtung für 10 min. </li><li> Blockierlösung entfernen und ersetzen mit 100 ul primären Antikörper, die entsprechend in 10% normalem Ziegenserum verdünnt worden. Inkubation bei RT mit sanften Dreh für 16 Stunden. </li><li> Primären Antikörper zu entfernen und ersetzen mit 750 ul Waschpuffer. Die Röhrchen auf einem Kolbenpendel und lassen bei RT für 10 min nutieren. Hinweis: Der primäre Antikörper kann (Lagerung bei 4 ° C) gespeichert und später wiederverwendet werden. Wiederverwendung von Antikörpern mehrere Male bei der Verringerung der nicht-spezifischen Bindung zu helfen. </li><li> Ermöglichen, sich an die Unterseite des Rohres absetzen, dann entfernen Waschpuffer und 100 l Sekundärantikörper, die entsprechend in 10% Normalserum verdünnt worden. Inkubation bei RT mit sanften Dreh für 2̵1, 4 Stunden. </li><li> Entfernen Sekundärantikörperlösungen aus Gewebe und ersetzen mit 500 ul Waschpuffer. Gewebe ermöglichen, auf den Boden des Röhrchens zu begleichen. </li><li> Mit Hilfe eines P-200 und einen Schnitt gelber Spitze, übertragen alle Gewebe seziert, um einen Pool von Waschpuffer, die auf dem Seziertisch Schale gelegt wurde. Während mit dem nächsten Schritt der Fein Dissektion fortfahren, wird das Gewebe in der Waschpuffer inkubiert. Dies hilft, überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen. </li></ol> 4. Fein Dissektion der Eye-Antennallobus Disc-Komplexe und Montage auf Folien <ol><li> Verwenden Sie eine Pinzette, um die Nagelhaut von den Mundhaken mit der Bauchseite des Komplexes nach unten falten. Mit einer zweiten Pinzette entfernen Sie die beiden Hirnlappen durch Schließen der zweiten Pinzette in den Raum zwischen dem Gehirn und Auge-Discs (Bild 3, roter Pfeil) und schnell zieht das Gehirn weg von den Mundhaken. </li><li> Während Sie auf die Mundhaken halten, kneifen Siedas Gewebe so nahe wie möglich an der Verbindung zwischen dem Antennenteil des Blickantennenscheibe und den Mund Haken (3, blauer Pfeil). Hinweis: Die Augenantennenscheibe Komplexe sollte frei von allen Geweben (Abbildung 1A) sein. Fortfahren, bis alle gewünschten gewünschte Gewebe, die auf Objektträger platziert werden können wurde seziert. Dieses Protokoll kann angepasst an Flügel, Haltere, Bein-und Genital Imaginalscheiben (Abbildung 1B-E) zu isolieren. </li><li> Fügen Sie zwei kleine Stücke von Tissue-Papier (Größe der Deckgläser) in ca. 3. Auseinander auf dem Seziertisch Gericht. Ein Glasobjektträger, auf dem Teller - die zwei Stücke von Tissue-Papier soll unter den Enden des Schiebers sein. Dies wird die Folie vom Kleben an der Silikonbasis der Seziersaal Gericht zu verhindern. </li><li> Verwendung eines P-20 mit einem ungeschnittenen Spitze hinzuzufügen 9 ul eines Anti-Bleichmittels zu der Mitte der Glasobjektträger. Dies verhindert, dass Bleichen der Gewebe, wenn mit fluoreszierenden angesehenLicht. </li><li> Mit der gleichen uncut Spitze, sammeln alle Augenantennenscheiben und fügen Sie sie der Tropfen Anti-Bleichmittel. Minimieren Sie die Anzahl der Waschpuffer, die über durchgeführt wird. Versuchen, die Menge an Waschpuffer auf 10 ul oder weniger zu begrenzen. </li><li> Verwenden Sie eine Pinzette zu trennen und verteilen Sie die Augenantennenscheiben innerhalb des Tropfens von Anti-Bleichmittel. Lassen Sie Discs in der Anti-Bleichmittel für einige Minuten inkubiert. Hinweis: Scheiben wird sich klar, wie das Gewebe absorbiert die Anti-Bleichmittel. </li><li> Mit einem feinen Pinsel vorsichtig senken einen Deckglas auf die Probe. Dies verhindert die Bildung von Luftblasen. </li><li> Objektträger bei -20 ° C bis bereit, die Auge-anten oder andere Imaginalscheiben mit Hilfe von Licht oder Fluoreszenzmikroskopie zu sehen. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Obgleich dieses Verfahren weitgehend auf die Isolierung und nachfolgende Behandlung von Augenantennenscheiben konzentriert, ist es zugänglich ist zur Isolierung und Analyse des Flügels Haltere, Bein-und Genitalscheiben (4). Die einzige erforderliche Änderung des Protokolls zur Isolierung dieser Scheiben (im Gegensatz zum Auge-Antennenscheibe) ist die Methode der Grob Dissektion (Abschnitt 2 des Protokolls). Die ersten Brustbein (T1) Paar wird an der vorderen der Larve gefunden und kann durch das Prot...

Seit mehr als einem Jahrhundert die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist einer der führenden System-Entwicklung, Verhalten und Physiologie zu studieren. Embryonalen und post-embryonale mit viel der letzteren stattfindet in Mono Epithelien genannt Imaginalscheiben 1-3: Entwicklung in der Fliege können in zwei große Phasen unterteilt werden. Zeichnungen von Imaginalscheiben wurden erstmals im Jahre 1864 von August Weismann als Teil seines breiten Monographie über Insektenentwicklung 1 veröffentlicht. Diese Scheiben ihrer Entwicklung beginnen während der Embryogenese, werden während der Larvenstadien gemustert, überleben die massiven Histolyse der frühen Puppenstadien und schließlich führen zu einem hohen Prozentsatz der erwachsenen Strukturen, die in der Erwachsenen gefunden werden fliegen 1-14. Während Larvenentwicklung jede Scheibe macht mehrere kritische Entscheidungen in Bezug auf das Schicksal, Form und Größe. Innerhalb der ersten und zweiten Larvenstadien werden die Discs mit der Annahme einer primären Schicksal beauftragt, establisHing Fach Grenzen, die Annahme der richtigen Form und die Erzeugung der erforderlichen Anzahl von Zellen 15-16. Während des dritten Larvenstadium und frühen Pre-Puppenstadium, die Imaginalscheiben weiter teilen und strukturiert, wie Zellen ihre Schicksale Terminal 16 erlassen. Während der frühen Geschichte der Drosophila Entwicklungsbiologie, wurden fast ausschließlich Imaginalscheiben im Rahmen der normalen Entwicklung und in den wenigen Fällen, in denen ein Verlust oder Gewinn-of-function-Mutante lebensfähig war sucht. Die Verwendung von Röntgenstrahlen zu veran mitotische Rekombination zur letalen Mutationen erlaubt, in Zellklone in den Larven und erwachsenen Geweben analysiert werden. Dieses Verfahren wurde durch die Einführung von transgenen Verfahren verbessert worden, um den Verlust zu analysieren und gain-of-function Mutationen sowohl Larven und adulten Geweben. Die Anzahl der Antikörper, Transkriptions Reporter und Protein-Traps für die Beschreibung der molekularen Landschaft von Wildtyp und Mutante Gewebe ist auch constantly wächst. Mit Hilfe dieser molekularen Marker, um den Verlust zu analysieren und gain-of-function-Mutante Zellklone hat es immer möglich, eine Echtzeit-Verständnis, wie mutierten Zellen während der Entwicklung von ihren Wildtyp abweichen Vettern zu gewinnen. Um richtig nutzen diese Werkzeuge und Reagenzien ist es wichtig, qualitativ hochwertige Präparate von Imaginalscheiben, die angezeigt werden können, fotografiert und analysiert haben. Das Ziel dieses Manuskript ist, um ein optimiertes Protokoll für die Isolierung und Herstellung der augenAntennenScheibe Komplex (Figur 1A) zu liefern. Es kann auch erfolgreich verwendet, um eine Vielzahl von zusätzlichen Scheiben einschließlich derjenigen, die zu den Flügeln halteres, T1-T3 Beine und die Genitalien (1B-E) erhalten wird, zu isolieren. Dieses Verfahren, mit geringfügigen Modifikationen, wurde verwendet, um Imaginalscheiben von Drosophila für fast 80 Jahre zu isolieren. Wie oben beschrieben, da die meisten Gene während mu exprimiertltiple Entwicklungsstufen und in einer Vielzahl von Geweben, ist es oft nicht möglich, die Effekte zu untersuchen, dass Null-Mutanten wurden auf der gesamten Augen das Tier stirbt, und vor dem dritten Larvenstadium Larvenstadium. Vier Methoden wurden die Untersuchung weiter entwickelten Geweben wie der Retina wesentlich leichter handhabbar gemacht. Die erste ist die Flippase (FLP) / Flippase Rekombination Target (FRT) Verfahren zur Erzeugung von Mutanten-Zellklone in einem ansonsten Wildtyp-Gewebe 17-19. In diesem Fall wird das mutierte Gewebe wird durch das Fehlen einer visuellen Markierung, wie Green Fluorescent Protein (GFP) identifiziert und an die umliegenden Wildtyp-Gewebe, in dem GFP vorhanden ist (2D) verglichen werden. Das zweite ist das &quot;FLP-out&quot;-Methode, in der ein Transgen in einer Population von Zellen 20 ausgedrückt. In diesem Fall sind die Zellklone werden durch die Anwesenheit von GFP identifiziert und auf die umliegenden Wildtyp-Gewebe, das die GFP-Reporter fehlt (Abbildung Vergleich2E). Die dritte ist die Mosaik-Analyse mit einem Reprimierbare Zellmarker (MARCM)-Technik, die Elemente des FLP / FRT-Mutante Klon und FLP-out-Expressionssysteme 21 verbindet. Mit diesem Verfahren wird ein Transgen in einer Population von Zellen, die gleichzeitig für einen einzelnen mutierten genetischen Locus exprimiert werden. Wie FLP-out-Klone sind Klone MARCM durch die Anwesenheit von GFP identifiziert und im Vergleich zu den umliegenden Wildtyp-Gewebe, das die GFP-Markierung (2F) fehlt. Und schließlich können die Gene und RNAi-Konstrukten in imaginal Gewebe unter der Kontrolle spezifischer Promotor GAL4-Konstrukten exprimiert werden. Diese vier Methoden haben das Interesse an einem Studium Imaginalscheiben seit Mutante oder Überexpression Klone oder Muster können direkt miteinander verglichen werden, um benachbarte Wildtyp-Gewebe erhöht. Die in diesem Verfahren beschriebenen Methode wurde so entwickelt, dass Forscher, die die post-embryonale Entwicklung von adulten Geweben in Drosophila zu untersuchen,insbesondere aus dem Blickantennenscheibe stammen, werden in der Lage, qualitativ hochwertige Gewebe für die Analyse zu erhalten. Obwohl einzelne Forscher haben leichte Modifikationen vorgenommen, hat der Kern dieses Verfahrens (die wir hier beschreiben) weitgehend unverändert geblieben. Seit Erlangung hochwertigen Gewebe ist entscheidend, um das Studium der Imaginalscheiben wir hoffen, dass dieses Protokoll geschrieben und dazugehörige Video wird als wertvolles Lehrmittel dienen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="915">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:165px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:360px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Used to create base for dissection plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pryex Glass Petri Dish 150x20mm</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3160-152CO</td>
			<td>Use the cover for dissection plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#5 Dissecting Forceps</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>525</td>
			<td>Forceps must be kept very sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">9 well watch glass</td>
			<td>Vairous Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for fixation of imaginal disc complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Erlenmeyer Flask</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Small Stir Bar</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Small enough to fit into Erlenmeyer Flask</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Conical Tubes</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5ml Microfuge Tubes</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clear or Dark depending upon application</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge Rack</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benchtop Rotator</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>100ul volume should not splatter at low setting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Macron Chemicals</td>
			<td>2-26555-1</td>
			<td>Serves as fixative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>S-3139</td>
			<td>Used to make dissection and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>71636</td>
			<td>Used to make dissection and wash buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>125221000</td>
			<td>Used in the fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Periodate</td>
			<td>Sigma Chemical Co</td>
			<td>S-1878</td>
			<td>Used in the fixative solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>EMD Chemicals</td>
			<td>MTX1568-1</td>
			<td>Used to perforate imaginal discs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>EM Science</td>
			<td>SX0593-3</td>
			<td>Used to dissolve paraformaldehyde</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100% Normal Goat Serum`</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>Serves as a blocking solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary Antibodies</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seondary Antibodies</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Prevents bleaching of samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>48312-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Cover Slips 18x18mm</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12-542A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe Tissue</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>NA</td>
			<td>Prevents Glass slides from adhering to silicone base</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Panit Brush 000</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use to gently lower coverslip on to samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster

Ein wesentlicher Teil der Post-embryonalen Entwicklung in der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, findet innerhalb einer Reihe von sackartigen Strukturen genannt Imaginalscheiben. Diese Scheiben führen zu einem hohen Prozentsatz der erwachsenen Strukturen, die in die erwachsene Fliege zu finden sind. Hier haben wir ein Protokoll, das so optimiert wurde, um diese Scheiben zu erholen und bereiten sie für die Analyse mit Antikörpern, Transkriptions Reporter und Protein-Traps zu beschreiben. Dieses Verfahren ist am besten für dünne Gewebe wie Imaginalscheiben geeignet, kann aber leicht für die Verwendung mit dicker Gewebe modifiziert werden, wie die Larven und erwachsene Gehirn Eierstock. Die schriftliche Protokoll und begleitende Video den Leser / Betrachter durch die Zerlegung des dritten Larvenstadium, Fixierung von Gewebe, und die Behandlung von Imaginalscheiben mit Antikörpern führen. Das Protokoll kann verwendet werden, um Imaginalscheiben von jüngeren ersten und zweiten Larvenstadium sowie sezieren werden. Der Vorteil dieses Protokolls ist, daß sie relativ kurz ist, und es hat seinen für die hohe Qualität Erhaltung der sezierten Gewebe optimiert. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Fixierung Verfahren, das eingesetzt wird, funktioniert gut mit der überwiegenden Anzahl von Antikörpern, die Drosophila-Proteine ​​zu erkennen. Nach unserer Erfahrung gibt es eine sehr kleine Anzahl von empfindlichen Antikörper, die nicht gut mit diesem Verfahren arbeiten. In diesen Situationen wird das Heilmittel zu sein, um eine alternative Fixierung Cocktail nutzen und dabei die Richtlinien, die wir weiter für die Dissektion Schritte und Antikörperinkubationen haben zu folgen.

Die Methode, die oben beschrieben ist zuverlässig produziert hochwertige Material für die Analyse mit In-situ-Sonden, Transkriptions Reportern, Protein-Traps und Antikörper. In Abbildung 1 zeigen wir Augen Antenne, genital, Flügel, Haltere und Beinscheiben, die routinemäßig mit diesem Verfahren gewonnen werden. Diese Scheiben sind mit einer Phalloidin-konjugierten Fluorophor, die F-Aktin bindet und daher beschreibt jede Zelle behandelt. Wenn das Gewebe richtig dann die morphogenetischen F...

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Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

26.4K Aufrufe.  Indiana University. The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Serie: Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection der Larven ZNS von Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Forschung

Biologie

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Dissection der Imaginalscheiben vom 3. Instar Drosophila-Larven

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila Larven NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Live-Imaging von Gliazellen Migration in der Drosophila Eye Imaginalscheibe

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Präparation Oenocytes von Adult Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection und Färbung von Drosophila Larven Ovarien

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolierung von Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Messung der Lebensdauer in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Dissection und Montage<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...