Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в иммунологической области человека, такие как, как связь между лейкоцитами происходит на молекулярном и клеточном уровне. Основным преимуществом этой техники является то, что неочищенные Т-клетки человека могут быть проанализированы ex vivo в относительно короткий период времени. Демонстрацией этой процедуры будет Хеннинг Кирхгесснер, техник из нашей лаборатории.
Начните с смешивания одного миллилитра свеженатянутой периферической крови человека с 30 миллилитров буфера лиза ACK в 50-миллилитровой конической трубке. После восьми минут при комнатной температуре, заполнить трубку с PBS для центробежной мыть и повторно гранулы в двух миллилитров культуры среды для 60-минутной инкубации при температуре 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации добавьте пять раз 10 к пятому золотистому стафилококку энтеротоксину B или SEB-загруженным или выгруженным клеткам Raji в 500 микролитров культурной среды в отдельные трубки FACS, а затем 650 микролитров пан-лейкоцитов.
Спин вниз со-культуры, и повторно гранулы в 150 микролитров свежей среды культуры для 45-минутной инкубации при 37 градусов по Цельсию. Затем осторожно вихрем клетки в течение 10 секунд при 100 об/мин при добавлении 1,5 миллилитров 1,5%paraformaldehyde. После 10 минут при комнатной температуре, остановить фиксацию с одним миллилитром PBS дополняется 1%BSA и собирать клетки центрифугации.
Перепробронить гранулы в 100 микролитров PBS плюс BSA и 0,1%saponin, и добавить образцы клеток в двух отдельных скважин 96-хорошо, U-нижней пластины. После 15 минут при комнатной температуре центрифуга пластины и повторно поместить гранулы в 50 микролитров PBS плюс BSA и сапонин, содержащий фторфор-конъюгированных антител или соединений, представляющих интерес для 30-минутной инкубации в темноте при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть клетки три раза в 150 микролитров PBS плюс BSA и сапонин и повторно гранулы в 60 микролитров PBS.
Чтобы изображение клеток по цитометрии потока, откройте программное обеспечение для анализа, проверьте уровень жидкости и нажмите Startup в меню инструмента. Затем нажмите Load и загрузите образцы в порт по запросу. Под вкладкой Illumination измените мощность лазера возбуждения на соответствующие длины нанометров.
Затем отрегулируйте ворота для каналов 4 и 11 и отрегулируйте область для первого канала. Чтобы оценить регулировки мощности от гатинга и лазера, переключитесь меню View на соответствующие ворота и отрегулируйте ворота и лазерные силы до тех пор, пока не будут видны клетки и клеточные пары. Затем, во вкладке Приобретение файлов, определите имя образца и количество изображений для приобретения и соответствующие ворота для окрашивания CD3 и нажмите Acquire, чтобы начать приобретение.
Для анализа приобретенных изображений клеток откройте соответствующее программное обеспечение для анализа. Следуя инструкциям в компенсации отсева, производить матрицу компенсации и сохранить матрицу в качестве comp даты ctm. Затем откройте образец файла необработанных изображений и примените ctm даты компа в окне для создания компенсированных файлов анализа изображений и данных по умолчанию.
Открыв компенсированные файлы изображений, переведими изображения в цветовой режим. Отрегулируйте таблицы поиска, чтобы получить оптимальные видимые цвета в панели инструментов Image Gallery Properties. Откройте Mask Manager в меню анализа и определите Т-клетки, выбрав 60%-ную маску для пятых каналов и заполнив маску для создания Т-клеточной маски.
Далее выберите маску Valley для канала 2 шириной три пикселя, чтобы создать маску Долины, и объедините Т-клетки и маски Долины для создания маски T-cell synapse. Чтобы вычислить общее выражение CD3 в Т-ячейках, откройте менеджер функций и создайте функцию Интенсивность, Т-ячейку, пятый канал. Чтобы вычислить общее количество F-актина в Т-клетках, создайте функцию Интенсивность, Т-клетки, шестой канал.
Чтобы оценить количество CD3 в иммунных синапсах, создайте функцию Интенсивность, T-клеточный синапс, пятый канал. Чтобы определить количество F-актина в иммунной синапсе, создайте функцию Интенсивность, T-клеточный синапс, шестой канал. Наконец, чтобы определить обогащение F-актина и CD3, рассчитать соотношения F-актина или CD3 в иммунной синапсисе и общее выражение выбранного белка, соответственно.
В этих графиках показан обзор критической стратегии гэтинга для количественной оценки обогащения белка в иммунной синапсисе между суррогатными клетками, представляя антигены, или БТРы, и Т-клетками в неочищенные пан-лейкоциты, взятые из малотоего образца крови человека. Здесь показаны репрезентативные изображения конъюгированных T-cell-APC с низким уровнем CD3 и F-актина в их иммунных синапсах в отсутствие SEB, в то время как эти конъюгаты T-cell-APC демонстрируют сильное обогащение CD3 и F-actin в присутствии SEB. При отсутствии суперантигена, 15% Т-клеток продемонстрировали обогащение как CD3, так и F-актина при иммунной синапзе, в то время как 29% обогащения наблюдается при наличии суперантигена.
Действительно, при отсутствии суперантигена, менее 20% от общего количества F-актина в клетках накапливается при иммунной синапзе, при этом более 30% наблюдается при синапсе при наличии суперантигена. Примечательно, что CD3 накапливается при иммунном синапсе даже при отсутствии суперантигена, хотя это накопление также значительно увеличивается за счет добавления суперантигена, демонстрируя пригодность этого метода для количественной оценки накопления белка при иммунной синапзе Т-клеток-АПК. После освоения, этот метод может быть завершен в шесть-семь часов, если выполняется должным образом.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы включить все соответствующие элементы управления, в том числе образцы без суперантигена, как обогащение белка также происходит, если БТР без SEB используются. После этой процедуры, другие методы, такие как микроскопия супер-разрешения могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о тонкой структуре иммунной синапзы. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области сотовой связи для изучения иммунной синапзы у людей для фундаментальных исследований, клинических испытаний и трансляционной науки.
После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как анализировать Т-клеток-APC соединительной зоны и иммунной синапзы в человеческих Т-клеток ex vivo. Не забывайте, что работа с первичными человеческими материалами может быть опасной и что такие меры предосторожности, как ношение перчаток или работа в условиях уровня биобезопасности два всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
