Целью метода является создание иммунологического синапса, который является примером спряжения от клетки к клетке, образованной антигеносиентной клеткой и Т-помощником лимфоцитов. Наша цель состоит в том, чтобы записать первые этапы формирования иммунного синапса и зафиксировать случаи торговли людьми, происходящие в лимфоцитах Т-помощников. Это в конечном итоге приведет к поляризованной секреции при иммунной синапсе.
Представленный здесь подход включает спряжение от клетки к клетке, приобретение замедленного действия, широкое флуоресцентную микроскопию и последующую обработку изображений. Это улучшает соотношение сигнала к шуму изображений, улучшает временное разрешение и позволяет одновременное приобретение нескольких флуорохромов при возникающих синаптических конъюгированиях и уменьшает отбеливание флуоресценции. Кроме того, протокол совместим с протоколами фиксации конечных точей клеток, которые позволят окрашивать и анализ иммунофлюоресценции.
Этот протокол также совместим с лазерной флуоресцентной микроскопией и другими самыми новыми методами микроскопии. Демонстрация процедуры будет Ана Белло, аспирант, Алехандро Гарридо, техник, и Соланж Морено, аспирант. Чтобы начать эту процедуру, добавьте 150 микролитров фибронектина к каждой колодец из восьми микроуровн камеры слайд и инкубировать его при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут до одного часа.
После инкубационный период, аспирировать фибронектин и мыть каждый хорошо с 200 микролитров ПВЗ в течение двух минут с нежной тряски. Повторите эту стирку еще раз и оставьте вторую стирку в колодец. Перенесите 10 миллилитров стеченной докультуры клеток Раджи в 15 миллилитровую V-нижнюю трубку.
Центрифуга при температуре 300 Г и при комнатной температуре в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и аккуратно повторно посовелите клеточные гранулы в теплую, полную среду при концентрации 1 миллиона клеток на миллилитр. Чтобы обозначить клетки Раджи, перенесите необходимое количество клеток в среде культуры на двухмилитровую трубку.
Для восьми микроуэлл камеры слайд, в общей сложности 1,6 миллилитров клеточной подвески не требуется. Добавьте клеточный трекер синий до конечной концентрации 10 микромолей. Resuspend ячейки трекер сине-окрашенных клеток и передачи 200 микролитров клеточной подвески в каждый колодец подготовленных фибронектин покрытием камеры слайдов.
Инкубировать камеру слайд на 37 градусов по Цельсию с пятью процентами углекислого газа в течение 30 минут до одного часа. После этого аккуратно встряхните камерные слайды на микроскопе, чтобы убедиться, что клетки Раджи придерживаются. Вымойте каждый хорошо тщательно с теплой, полной среды культуры клеток, чтобы устранить избыток ячейки трекер синий.
Убедитесь, что клетки Раджи прилипли к нижней части пластин, и они отображают пробелы между собой, и они не стекут. 50-60% клеточного слияния является целесообразным. Во-первых, добавить стафилококк энтеротоксин Е при концентрации одного микрограмма на миллилитр к каждой хорошо.
Убедитесь, что клетки Раджи пульсировать с суперантигеном в противном случае Т-клеточный рецептор из клеток Jurkat не признают SCE и синапс не будет сформирован. Инкубировать камеру слайд на 37 градусов по Цельсию с пятью процентами углекислого газа, по крайней мере 30 минут. Далее, получить ранее растущую культуру клеток Jurkat в концентрации от 1 до 2 миллионов клеток на миллиметр.
Наблюдайте за клетками под фазовой контрастной микроскопом, а затем перенесите клетки в 15-миллилитровую V-нижнюю трубку. Центрифуга при температуре 300 Г и при комнатной температуре в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и аккуратно посовелите клетки в теплую, полную культурную среду с концентрацией 1 миллион клеток на миллилитр.
Затем поддерживать клетки Jurkat в культуре на 37 градусов по Цельсию с пяти процентов углекислого газа до готовности к использованию. Извлеките камерные слайды, содержащие клетку трекера с синей маркировкой Staphylococcus Enterotoxin E импульсно-придерживающихся клеток Raji из инкубатора. Тщательно аспирировать культуру среды из каждого хорошо один за другим с пипеткой размещены в углу колодец.
Немедленно замените среду 200 микролитров рсуспенных клеток юрката в среде клеточной культуры. Если промежуток времени выполняется, быстро перейти к микроскопу. Найдите камерный слайд на микроскопе постановки официанта и выберите некоторые соответствующие поля.
Подготовь микроскоп и инкубационную камеру перед визуализацией. После того, как клетки Jurkat были добавлены в каждый колодец, содержащий клетки Раджи, быстро найдите микроухоженную камеру слайда на разогретом микроскопе постановочном инкубаторе и выберите некоторые позиции XY. Если планируется только эксперимент с конечной точкой, инкубируйте слайд камеры при 37 градусах по Цельсию с пятипроцентным углекислым газом в течение одного-двух часов.
После периода культуры проверьте наличие спряжения и впоследствии исправьте спряжения, изложенные в текстовом протоколе. Чтобы исправить клетки, добавить теплый RPMI без FCS и осторожно встряхнуть. Аспирировать RMPI и добавить 200 микролитров либо PFA или prechilled ацетон для каждой хорошо.
Инкубировать камерную горку при комнатной температуре или на льду в течение 20 минут. Затем мыть каждый хорошо дважды с ПВХ и добавить 200 микролитров утоляющий раствор. В этом исследовании, Jurkat-Raji иммунной синапсис конъюгации генерируются и на ранних стадиях иммунологического формирования синапса должным образом изображены.
Эта стратегия индуцирует иммунологическое образование синапса при одновременном выполнении изображений промежуток времени. Здесь показаны репрезентативные синаптические конъюгации Jurkat-Raji, полученные из этой техники, включая изображение канала передачи, голубого канала сотового трекера, и оба этих канала слились. Некоторые синаптические конъюгаты можно увидеть, в том числе из одной клетки Jurkat и нескольких клеток Раджи, которые являются сложными спряжениями.
Снижение концентрации клеток позволит обойти образование сложных клеточных конъюгированных, но не может обеспечить достаточное количество сотовых конъюгированных для последующего анализа поляризованного трафика, что, в свою очередь, уменьшит шансы найти и изобразить возникающие синаптические конъюгаты. Деконволюция изображений канала флуоресценции GFP-CD63 выполняется с соответствующим программным обеспечением для деконволюции с использованием широкого оптического варианта поля и соответствующих оптических параметров. Этот деконволюция канала впоследствии была объединена с ячейкой трекера синий широкий канал.
Существует улучшение как соотношения сигнала к шуму, так и резкости. Здесь показана репрезентативная стек фиксированной иммунологической конъюгации синапса. Иммунофторесценция выполняется с использованием фаллоидин для визуализации F-актина, анти-CD63 для визуализации MVB, и анти-гамма-тубулин для визуализации MTOC в то время как клетка трекер синий помечены клетки Raji.
Необязательное замирание клеток юрката позволит визуализировать движение секреторных гранул в живых клетках. Например, при выражении GFP-CD63 можно фиксировали движение украшенных GFP-CD63 пузырьков. Протокол совместим с протоколами фиксации конечных точей, которые позволят дополнительно окрашивать и анализировать иммунофлуоресценции.
Продуктивность экспериментальных моделей существуют, которые могут упростить визуализацию в иммунной синапзы, но эти модели не подражать сложной и нерегулярной поверхности на антиген-ведущих клеток, которые могут производить не-физиологических взаимодействий на иммунной синапса. Описанный здесь подход подходит для воспроизведения и подтверждения некоторых биологических сложностей, возникающих при иммунной синапсе. Superantigen является опасным токсином, поэтому, пожалуйста, не забудьте надеть перчатки, и падение использованный наконечник на опасной коробке.
