Этот метод позволяет генерации большого количества человеческих прародителей почки печени и гепатоцитов, как клетки с высокой чистотой. Способность генерировать эти клетки печени может иметь важное значение для регенеративной медицины и других областях. Контролируя пути сигнализации развития для содействия дифференциации печени и подавления формирования нежелательных типов клеток, этот метод позволяет эффективное поколение прогениторов почки человека и гепатоцитов, как клетки на шесть и 18 дней дифференциации соответственно.
Основным преимуществом этой техники является высокая чистота генерируемых клеток печени человека. Чтобы быть этой процедурой, добавьте 50 миллилитров IMDM в коническую колбу, содержащую бар для перемешивания. Нагрейте средний до 50 градусов по Цельсию и добавьте 0,5 грамма PVA, непрерывно помешивая, чтобы подготовить запас PVA при концентрации 10 миллиграммов на миллилитр.
После этого снимите раствор PVA с грелки и дайте ему остыть до комнатной температуры. Как только раствор остынет, процепив его через стерильный фильтр 0,2 микрометра. Подготовь CDM2 и CDM3, объединив отфильтрованную PVA с другими реагентами, изложенными в таблице одного из текстовых протоколов.
Используйте стерильный 0,2-метровый фильтр для фильтрации всех средств массовой информации. Затем подготовь оставшиеся базовые средства массовой информации, CDM4 и CDM5, как указано в таблице одного из текстовых протоколов. Чтобы подготовить дифференциацию среды, сначала оттаивать замороженные мелкие молекулы и / или факторы роста при комнатной температуре.
Aliquot из необходимого количества базовой среды и добавить указанные малые молекулы и факторы роста в базовую среду в соответствующих концентрациях. За день до начала использования оттаивать матрицу при четырех градусах по Цельсию. На следующий день разбавляют матрицу в соотношении от одного до 100, добавляя 500 микролитров матрицы в 50 миллилитров холодного DMEM.
Пипетка разбавленной матрицы в нужное количество скважин, используя достаточное количество раствора для покрытия поверхности скважины. Перенесите матричную пластину в инкубатор при 37 градусах по Цельсию, по крайней мере, на 60 минут. Непосредственно перед посевом, аспирировать оставшийся матричный раствор из покрытых скважин.
Затем, аспирировать среды из в значительной степени confluent hPSC культуры пластины и добавить коммерчески купил диссоциации агента, убедившись, что использовать достаточно, чтобы покрыть поверхность, на которой клетки растут. Инкубировать HPSCs в диссоциации агента при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут или до тех пор, пока некоторые колонии начинают отделяться. Затем добавьте DMEM и F-12, чтобы разбавить диссоциацию.
Используйте пятими миллилитровую серологическую пипетку, чтобы аккуратно пипетку вверх и вниз несколько раз, чтобы смыть все клетки с поверхности колодец. Соберите перерасход одиночных ячеек в 50 миллилитровой конической трубки и разбавьте DMEM и F-12 по мере необходимости. Центрифуга этой трубки собранных HPSCs в 350 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение трех минут, чтобы гранулировать клетки.
В ожидании центрифугации, аспирировать матрицу от пластины, в которой HPSCs будут посеяны. Добавьте достаточное количество средств массовой информации mTeSR к скважинам-получателям, чтобы покрыть их. Когда центрифугация завершена, тщательно аспирировать супернатант, оставляя гранулированные HPSCs в нижней части конической трубки.
Повторное разрешение клеточной гранулы в mTeSR дополнено одним микромолярем коммерчески полученного Тиазовивина. Используя пипетки P1000, аккуратно тритурировать два-три раза, чтобы равномерно повторно использовать клеточные гранулы в одноклеточную подвеску. Сразу же пипетка 10 микролитров клеточной подвески в гемоцитометр и подсчитать количество клеток.
Отрегулируйте объем перерасхода ХПСЦ с помощью Тиазовивина, дополненного mTeSR, чтобы достичь желаемой концентрации клеток для покрытия. Затем встряхните пластину крестом несколько раз, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены. После hPSCs были поцарыны в течение по крайней мере 24 часов, использовать фазовой контрастный микроскоп, чтобы проверить морфологию клеток с конкретным акцентом на диаметре потроха hPSC колоний.
Далее подготовьтесь к следующему дню дифференциации APS, как указано во второй таблице текстового протокола. На следующий день после посева, аспирировать Тиазовивин-дополненный mTeSR из покрытых HPSCs и кратко мыть их с IMDM средств массовой информации. После этого добавьте среду первого дня в HPSCs.
Завехай время и поместите клетки обратно в инкубатор при 37 градусах по Цельсию. Продолжить последующие шаги дифференциации, подготовив необходимую дифференциацию среды и добавить его в клетки в соответствующие дни дифференциации примерно в то же время суток. В этом исследовании, обогащенные популяции прогениторов почки печени, а затем гепатоцитов, как клетки генерируются из HPSCs.
На второй день дифференциации, примитивные клетки полосы дифференцированы в день два окончательных эндодерм клеток. Подавляющее большинство этих клеток выражают SOX17 и FOXA2. На третий день дифференциации, эндодерм клетки дифференцированы в предтечные прародители, которые появляются полигональной формы.
Позже, на шестой день, прародители протеготов дифференцированы в печень почки прародителей. Эти прогениторы почек печени выражают AFP, TPX3 и HNF4alpha. Через три линии hPSC, этот метод генерирует день шесть AFP-положительных прогениторов печени с эффективностью около 89%, Наконец, после 18 дней дифференциации печени от HPSCs, альбумин-положительные гепатоциты, как клетки появляются.
Морфологически эти клетки появляются эпителиальными, образуя яркие границы, напоминающие желчные каналикулы. На этом этапе цитоплазма дня 18 hPSC полученных гепатоцитов появляется темнее, чем ядро. При посеве человеческих плюрипотентных стволовых клеток для дифференциации, крайне важно, чтобы семена их в нужной плотности, а также распространять их по всему колодец, встряхивая пластины.
Способность производить гепатоциты человека в пробирке является благоприятной технологией, которая позволит ученым исследовать механизмы, лежащие в основе развития печени. Этот метод производит большое количество человеческих гепатоцитов in vitro, которые могут быть использованы для исследования функции печени и болезней и в конечном итоге включить новые методы лечения печеночной недостаточности.
