Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении механизмов захвата, таких как, какие нейронные субпопуляции несут ответственность за электрографические начала захвата и прекращения. Основным преимуществом этой техники, является то, что он может воспроизводить электрографические события захвата, по требованию, и in vivo и in vitro модели, которые напоминают те, которые наблюдаются клинически. Этот метод также может быть использован для поиска потенциальных анти-изъятия терапии, пытаясь вызвать электрографические события захвата во время применения различных анти-изъятия наркотиков кандидатов.
Чтобы подготовить корковые ломтики, клей доклинковой ткани мозга на стадии вибромы, используя мгновенный клей. Аккуратно поместите держатель specimin в буферный лоток. Убедитесь, что спинная часть мозга сталкивается с лезвием вибромы.
Нарежьте мозг на 450 микрометров толщиной разделов, в спинной к брюшной направлении. Сделайте первый разрез в доклинкическом мозге животного, чтобы удалить обонятельную луковицу. Затем сделайте последующие разрезы до тех пор, пока не будет наблюдаться зона соматосензорного двигателя.
Используйте широкий родила пипетки. Перенесите целевые корональных ломтиков в чашку Петри, содержащую холодный раствор вскрытия. Для корональных ломтиков, сделать поперечный разрез чуть ниже нео корковой комиссариата, а затем, вырезать в средней линии, чтобы отделить полушария.
Затем используйте новое лезвие бритвы, чтобы отрезать излишки ткани от ломтиков. Очень важно эффективно выполнять процедуру нарезки мозга. Каждый момент ткани мозга не погружается в ACSF, наносит ущерб его качеству.
Поврежденные, низкого качества ткани мозга менее вероятно, для создания электрографических событий захвата. Перенесите спинную часть корональных ломтиков, содержащих нео-кору, на вторую чашку Петри, наполненную 35 градусами по Цельсию ACSF, на мгновение. Затем, быстро передать ломтики инкубационой камеры, содержащей 35 градусов по Цельсию карбогенированных ACSF.
Оставьте ломтики мозга слегка погруженными в инкубационую камеру при 35 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Затем снимите инкубационую камеру с водяной ванны и дайте ей вернуться к комнатной температуре. Подождите один час, пока ломтики мозга, чтобы восстановить, прежде чем выполнять электрофизиологические записи.
В этой процедуре, вырезать бумагу объектива, который немного больше, чем ломтик мозга. Используйте широкозвуковые пипетки или подробно кисть для передачи мозга ломтик на вырезанную бумагу объектива, который проводится на месте с помощью зубного пинцета. Затем перенесите бумагу объектива с ломтиком мозга в камеру записи и закрепите ее в положение экраном арфы.
Впоследствии обильное срез мозга в камере записи с карбогенированным ACSF при 35 градусах по Цельсию со скоростью три миллилитров в минуту. Используйте цифровой термометр, чтобы обеспечить запись камеры от 33 до 36 градусов по Цельсию. Затем заполнюйте стеклянные электроды 10 микролитров ACSF, используя шприц Гамильтона.
Под 20 раз стереомикроскоп, руководство записи стеклянный электрод в поверхностный корковый слой, два, три, с помощью ручных манипуляторов. Просмотр электрической активности мозга с помощью стандартного программного обеспечения. Чтобы вызвать электрографические захвата, как деятельность, обильное срез мозга с ACSF содержащие 4-AP на 100 микромолей.
Просмотр электрической активности мозга с помощью стандартного программного обеспечения. Для генерации электрографических захватов, как события, используя оптогенетической стратегии на ломтики мозга от оптогенетических мышей, использовать ручной манипулятор для позиционирования 1000 микрон диаметром шнура оптического волокна непосредственно над областью записи. Нанесите короткий пульс синего света, чтобы инициировать событие ictal.
Для обнаружения и классификации различных типов эпилептиформных явлений, происходящих в моделях in vitro и in vivo 4-AP, была специально разработана пользовательская программа MATLAB. Эта программа обнаружения доступна в репозитории GitHub Valiante Labs. Применение 100 микромолейных 4-AP к хорошему качеству 450 микрон размера корковых ломтиков мозга от ювенильной мыши канала VGAT, надежно индуцированных периодических ictal-подобных событий в течение 15 минут.
Применение 100 микромолейных 4-AP к ломтикам низкого качества, привело к взрыву событий или пиковой активности. В среднем, 40% ломтиков от каждого расчлененного доклинального мозга, успешно генерируется ictal-подобных событий. Кроме того, 83% расчлененных мышей привели, по крайней мере, к одному срезу мозга, который успешно генерируется ictal-подобных событий.
В ломтиках мозга с спонтанно происходящими ictal-как события, применение краткого 30 миллисекундного светового импульса на ломтик мозга, надежно вызвало ictal-как событие, которое было идентичным в морфологии. Такие же заключения были сделаны в ломтиках мозга от Thy одного Channelrhodopsin 2 мышей. Таким образом, независимо от того, какая нейрональная субпопуляция была активирована, любое краткое событие синхронизации в изолированной корковой нейронной сети, привело к наступлению ictal-как событие.
Эти ictal-подобные события состояли из дозорного шипа, тонизирующего стрельбы, клонической стрельбы и взрыво-подобной активности ближе к концу. По своему характеру они были похожи на электрографические подписи, связанные с клиническими изъятиями. После этой процедуры, другие типы переходов состояния мозга могут быть выполнены для решения таких вопросов, как, каковы нейро биологические механизмы, лежащие в основе переходов состояния мозга?
И как мы можем регулировать эти переходы, чтобы предотвратить вступление в различные патологические состояния мозга?
