Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенеративной медицины, например, где стволовые клетки зубного фолликула человека могут быть генетически модифицированы для улучшения их терапевтических свойств. Основным преимуществом этого метода является то, что стволовые клетки могут быть изменены путем введения микроРНК без опасности стабильной интеграции генома. Начните процедуру для энзиматического пищеварения двух фолликулов, предварительно нагревая до комнатной температуры, стволовых клеток зубного фолликула человека или hDFSC культуры среднего и PBSPSG раствора.
Оттепель один aliquot каждый из коллагеназы типа I и Dispase II фондовых решений. Подготовь решение для пищеварения, добавив 500 микролитров раствора коллагеназы типа I и 500 микролитров раствора бульона Dispase II в 4 миллилитров Базальной среды, содержащей 1%-ю антибиотико-препарат. Чтобы избежать загрязнения сайта во время изоляции стволовых клеток человека стволовых клеток мыть буферов и культуры средств массовой информации, используемые должны содержать антибиотики агентов.
Поместите извлеченный зубной фолликул в стерильную чашку Петри. Добавьте 10 миллилитров раствора PBSPSG для мытья извлеченных тканей. Аспирировать и отказаться от раствора и добавить свежий раствор PBSPSG повторить мыть.
Используя стерильный скальпель фарш извлеченный фолликул на куски, если около 1 на 1 миллиметр. Перенесите рубленую ткань и раствор PBSPSG из чашки Петри в 50-миллилитровую коническую центрифугу, вымойте чашку Петри 10 миллилитров раствора PBSPSG и перенесите раствор в ту же трубку. Центрифуга конической трубки при температуре 353 х г при комнатной температуре в течение десяти минут.
Добавьте 5 миллилитров раствора пищеварения в поддонную ткань, аккуратно смешайте раствор и ткань, инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию и 5%CO2 в трясущимся инкубаторе в течение двух часов. Через два часа центрифуга усваивается клеточной и тканевой суспензией при температуре 353 г в течение десяти минут при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте полученный поддон в 6 миллилитров среды культуры HDFSC.
Семя подвески клетки в 25 квадратных сантиметров клеточной культуры колбу, и инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию. После сбора клеток и характеристики HDFSC, как описано в текстовом протоколе, семена hDFSCs в 24 хорошо пластины культуры клеток. Инкубация при 37 градусах по Цельсию, 5%CO2 и 20%Кислород в течение 24 часов.
На следующий день разбавить 40 пикомолов микроРНК в 66,7 микролитров уменьшенной среды сыворотки и вихрем раствора. Разбавить 0,67 микролитров катионных липидов на основе, трансфекции реагента в 66,7 микролитров уменьшенной среды сыворотки, вихрь раствора, и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Через пять минут добавить предварительно разбавленную микроРНК в преразумый трансфектный реагент, смешать раствор и инкубировать при комнатной температуре в течение пятнадцати минут.
Затем добавьте подготовленные сложности трансфекции, dropwise, непосредственно к среде культуры на клетках. Смешайте осторожно, качая 24 хорошо пластины культуры клеток вперед и назад. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов.
Через 24 часа после трансфекции, собирать супернатант образцов в соответствующих 15 миллилитров конической центрифуги труб. Вымойте клетки с 1 миллилитров PBS, и передать PBS в соответствующие центрифуги трубки. Добавить 500 микролитров капель и ЭДТА в клетки, и инкубировать 24 хорошо пластины при 37 градусов по Цельсию, в течение 3 минут.
Остановите трипсинизацию, добавив 1 миллилитр среды клеточной культуры для клеток и переведя раствор в соответствующие центрифуги. Центрифуга клеток при 300 х г и 4 градуса по Цельсию в течение десяти минут. Отсюда держать клетки и реагенты на льду, если не указано иное.
Откажитесь от супернатанта, перерасходуйте клетки в 100 микролитров буфера окрашивания и перенесите клеточный раствор в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Добавьте 0,5 миллилитров реактивного красителя амина в каждый образец, чтобы различать живые и мертвые клетки. Аккуратно смешайте раствор и инкубировать при 4 градусах по Цельсию в течение десяти минут.
Добавьте 1 миллилитр PBS в клетки, и центрифуга при 300г и 4 градусах по Цельсию в течение десяти минут Отбросьте супернатант и повторно посовестите клетки в 100 микролитров PBS, добавьте 33 микролитера параформальдегида и смешайте растворы, храните образцы при 4 градусах Цельсия, защищенных от света до цитометрических измерений потока. Передача образцов в трубки, пригодные для цитометрических измерений потока, и выполнить цитометрию потока с использованием стратегии гэтинга, описанной в текстовом протоколе. Изолированные стволовые клетки стоматологического фолликула человека показали все характеристики, описанные для определения мезенхимальных стромальных клеток, клетки были пластиковыми адептами и отображали стекловолокно, как морфология, в стандартных условиях культуры.
Цитометрический анализ потока показал, что hDFSCs выразили панель некоторых поверхностных антигенов, включая CD29, CD44, CD73, CD90 и CD105. В то время как CD45 и CD117 отсутствовали. Адипогенный, остеогенный и хондрогенный потенциал дифференциации клеток в специфических условиях культуры In Vitro был подтвержден иммуностай, жирным кислотным связывающим белком для:Остеокальцина и Аггрекана.
Стратегия гэтинга, используемая для количественной оценки цитотоксичности и Cy3 помечены микроРНК поглощения эффективности 24 часов после трансфекции, подтвердил поглощение микроРНК в 100% жизнеспособных клеток. Сопоставимое количество мертвых клеток в трансфицированных и нетрансфицированных образцах указывает на то, что микроРНК эффективно вводится без цитотоксического воздействия. Следуя этой процедуре, другие методы, такие как трансдифференцирование могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как пластичность Cytolab.
