Этот протокол демонстрирует усовершенствованный метод получения эпителиальных клеток зубов человека. Во время процедур трудно идентифицировать агрегированную клеточную гранулу. Будьте осторожны при работе с супернатантом, чтобы предотвратить потерю популяций клеток.
Для начала собирают зубные фолликулы во время хирургического извлечения пораженных третьих моляров. Начните процедуры изоляции клеток или храните зубные фолликулы при четырех градусах Цельсия в DPBS с 3% пенициллин-стрептомицин. Чтобы промыть зубные фолликулы, подержите зубной фолликул пинцетом и поместите его в промывочную трубку 1.
Осторожно встряхните его 10-15 раз. Выньте его и поместите в трубку 2. Опять же, встряхните его от 10 до 15 раз.
Наконец, выньте его и поместите в трубку 3, затем встряхните. После трехкратного мытья поместите зубной фолликул в 60-миллиметровую культуральную посуду. Измельчите ткань тканевыми ножницами до тех пор, пока зубной фолликул не станет пульповидным или мягким.
Используйте небольшой боковой участок чашки для культивирования, чтобы свести к минимуму потерю тканей. Смешайте по одному миллилитру коллагеназы типа 1 и раствора протеазы в конической трубке объемом 15 миллилитров. Переложите измельченную ткань в 15-миллилитровую коническую трубку, затем аккуратно встряхните ее и высиживайте в течение одного часа при 37 градусах Цельсия.
Добавьте в пробирку пять миллилитров 0,05% трипсина-ЭДТА. Встряхните его и высиживайте в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия. Готовят кератиноцитарную среду, содержащую кератиноцитарную сывороточную среду и 10% фетальную бычью сыворотку.
Добавьте три миллилитра кератиноцитарной среды в новую коническую трубку объемом 50 миллилитров. Поместите 40-микрометровый сетчатый фильтр поверх этой трубки. Далее аспирируют супернатант из трубки, содержащей ткань, серологической пипеткой 10 миллилитра и пропускают ее через ситечко.
Переложите собранную суспензию в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте трубку и удалите супернатант. Затем добавляют три миллилитра кератиноцитарной сывороточной среды.
Центрифугируйте еще три минуты и удалите супернатант. Поместите популяцию одиночных клеток в 60-миллиметровую культуральную чашку, используя кератиноцитарную среду, свободную от сыворотки. Выдерживайте культуральную посуду с конечным объемом пять миллилитров в увлажненной атмосфере 5% углекислого газа при 37 градусах Цельсия.
Клетки с эпителиальной морфологией появились в течение семи-10 дней после покрытия популяций одиночных клеток. Количество булыжниковых эпителиальных клеток варьировалось от одной до 10 на момент появления, и клетки со временем расширялись в колонии. Наиболее важным этапом является измельчение зубного фолликула на мелкие частицы.
Усиливает отделение одиночных клеток от ткани фолликула. Мезенхимальные клетки могут быть выделены из зубного фолликула человека. Сыворотка, содержащая культуральную среду, отбирает мезенхимальные клетки и ингибирует рост эпителия из популяций одиночных клеток.
Этот протокол предусматривает способ получения человеческих зубных эпителиальных клеток. Эпителиальные клетки, полученные из зубных фолликулов, могут быть использованы для изучения эпителиально-мезенхимальных взаимодействий зубов.
