Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine régénérative, comme lorsqu’une cellule souche du follicule dentaire humain pourrait être génétiquement modifiée pour améliorer leurs propriétés thérapeutiques. Le principal avantage de cette technique est que les cellules souches peuvent être modifiées par introduction de microARN sans risque d’intégration stable du génome. Commencez la procédure de digestion enzymatique des deux follicules, par préchauffage à température ambiante, cellule souche follicule dentaire humain ou milieu de culture hDFSC et solution PBSPSG.
Décongelez un aliquot chacun des solutions de stock de type I et Dispase II de Collagenase. Préparez une solution de digestion en ajoutant 500 microlitres de la solution de stock de type I de Collagène et 500 microlitres de la solution de stock Dispase II à 4 millilitres de basal medium contenant 1% d’agent antibiotique. Pour éviter la contamination du site pendant l’isolement des follicules dentaires humains, les tampons de lavage et les supports de culture utilisés doivent contenir des agents antibiotiques.
Placer un follicule dentaire extrait dans une boîte de Pétri stérile. Ajouter 10 millilitres de solution PBSPSG pour laver les tissus extraits. Aspirer et jeter la solution et ajouter la solution PBSPSG fraîche pour répéter le lavage.
À l’aide d’un scalpel stérile, émincer le follicule extrait en morceaux si environ 1 par 1 millimètre. Transférer le tissu haché et la solution PBSPSG de la boîte de Petri dans un tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres, laver la boîte de Petri avec 10 millilitres de solution PBSPSG, et transférer la solution dans le même tube. Centrifuger le tube conique à 353 x g à température ambiante pendant dix minutes.
Ajouter 5 millilitres de solution de digestion au tissu palettisé, mélanger délicatement la solution et le tissu, incuber le mélange à 37 degrés Celsius et 5% de CO2 dans un incubateur secouant pendant deux heures. Après deux heures, centrifuger la suspension digérée des cellules et des tissus à 353 g pendant dix minutes à température ambiante. Jeter le supernatant et suspendre à nouveau la palette obtenue en 6 millilitres de milieu de culture HDFSC.
Ensemencer la suspension cellulaire dans un flacon de culture cellulaire de 25 centimètres carrés et incuber les cellules à 37 degrés Celsius. Après la récolte cellulaire et la caractérisation du HDFSC est tel que décrit dans le protocole de texte, les hDFSCs de semences dans une plaque de culture de cellules de puits 24. Incuber à 37 degrés Celsius, 5% de CO2 et 20% d’oxygène pendant 24 heures.
Le lendemain diluer 40 picomoles de microARN dans 66,7 microlitres de milieu sérique réduit, et vortex de la solution. Diluer 0,67 microlitres de lipides cationiques à base, réaccfection transfection dans 66,7 microlitres de milieu sérique réduit, vortex de la solution, et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Au bout de cinq minutes, ajouter le microARN prédilué au réattribuant transfection prédilué, mélanger la solution et incuber à température ambiante pendant quinze minutes.
Ensuite, ajoutez les teints de transfection préparés, dropwise, directement au milieu de culture sur les cellules. Mélanger délicatement en berçant la plaque de culture 24 cellules bien dans les deux sens. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.
24 heures après la transfection, recueillir le supernatant des échantillons dans respectivement 15 millilitres tubes de centrifugeuse conique. Lavez les cellules avec 1 millilitre de PBS et transférez le PBS dans le tube de centrifugeuse respectif. Ajouter 500 microlitres de gouttes et d’EDTA aux cellules, et incuber la plaque de puits 24 à 37 degrés Celsius, pendant 3 minutes.
Arrêtez la trypsinisation en ajoutant 1 millilitre de milieu de culture cellulaire pour les cellules, et en transférant la solution dans le tube de centrifugeuse respectif. Centrifuger les cellules à 300 x g et 4 degrés Celsius pendant dix minutes. À partir de là, gardez les cellules et les réachageurs sur la glace, sauf indication contraire.
Jetez le supernatant, resuspendez les cellules dans 100 microlitres de tampon de coloration, et transférez la solution cellulaire à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Ajouter 0,5 millilitres de colorant réactif à l’amine à chaque échantillon afin de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. Mélanger délicatement la solution et incuber à 4 degrés Celsius pendant dix minutes.
Ajouter 1 millilitre de PBS aux cellules, et centrifugeuse à 300g et 4 degrés Celsius pendant dix minutes Jeter le supernatant et resuspendre les cellules dans 100 microlitres de PBS, ajouter 33 microlitres de paraformaldéhyde, et mélanger les solutions, stocker les échantillons à 4 degrés Celsius protégés de la lumière jusqu’à ce que le débit des mesures cytométriques. Transférez les échantillons dans des tubes adaptés aux mesures cytométriques du débit et effectuez la cytométrie du débit à l’aide de la stratégie de gating décrite dans le protocole texte. Les cellules souches de follicule dentaire humain isolées ont montré toutes les caractéristiques décrites pour la définition des cellules stromal mésenchymales, les cellules étaient adhérentes en plastique et ont montré une fibre de verre comme la morphologie, dans des conditions standard de culture.
L’analyse cytométrique de flux a indiqué que hDFSCs a exprimé un panneau de certains antigènes de surface, y compris CD29, CD44, CD73, CD90, et CD105. Alors que le CD45 et le CD117 étaient absents. Les potentiels de différenciation adipogenic, osteogenic, et chondrogenic des cellules dans des conditions spécifiques de culture in vitro ont été confirmés par immunostaining, une protéine liant d’acide gras pour : Osteocalcin, et Aggrecan.
La stratégie de gating utilisée pour la quantification de la cytotoxicité et de l’efficacité d’absorption de microARN étiquetée Cy3 24 heures après transfection, a confirmé l’absorption de microARN dans 100% des cellules viables. Des quantités comparables de cellules mortes dans des échantillons transfectés et non infectés indiquent que le microARN est introduit efficacement sans effets cytotoxiques. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la transdifferentiation peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires comme la plasticité cytolab.
