Качество приготовленной одноклеточной суспензии имеет решающее значение для получения высококачественных и надежных результатов для любой методологии одноклеточной омики. И этот протокол покажет вам, как быстро, мягко и надежно изолировать клетки даже от очень сложных тканей. Основным преимуществом этого протокола является оптимизированная обработка тканей, которая позволяет диссоциировать ткани и изолировать клетки из большого количества образцов за короткое время с идеальным качеством.
Хотя этот метод был разработан для зубов мышей и человека, он также может применяться для других тканей, богатых внеклеточным матриксом, включая хрящ, кость или плотную соединительную ткань. Процедура изоляции зубных пульп от зубов человека и особенно мыши является сложной вручную. Мы советуем всем проверить это до начала реальных экспериментов.
Для начала подержите усыпленную мышь за головой, глядя на вентральный аспект головы так, чтобы хвост указывал в сторону. Используя маленькие и острые ножницы, быстро снимите кожу с нижней челюсти, чтобы обнажить нижнечелюстную дугу, мягкие ткани между каждой половиной нижней челюсти и прилегающими лицевыми мышцами. Для того, чтобы сделать глубокий разрез с каждой стороны нижней челюсти, сначала прорежьте массажер вдоль щечной стороны нижней челюсти до височно-нижнечелюстного сустава, а затем прорежьте вдоль внутренней части каждой половины нижней челюсти через основание ротовой полости.
Разрежьте все мышцы и связки вдоль нижней челюсти до височно-нижнечелюстного сустава как снаружи, так и изнутри ротовой полости. Возьмите нижнюю челюсть с помощью изогнутого пинцета и снимите ее. Затем ножницами прорежьте нижнечелюстной симфиз, чтобы расколоть рассеченную нижнюю челюсть на две половины.
Используйте промышленную салфетку с низким содержанием ворса, чтобы раздавить оставшиеся мягкие ткани с каждой половины нижней челюсти. После того, как обе части нижней челюсти очищены, поместите их в заранее приготовленную чашку Петри со льдом hbSS. Для рассечения нижнечелюстных резцов удаляют альвеолярный гребень со всеми тремя молярами и поперечно растрескивают нижнечелюстную дугу в месте, соответствующем положению между первым и вторым моляром.
Осторожно вытащите резец из остальной части зубной лунки. При необходимости удалите оставшиеся фрагменты кости, прикрепленные к резцу, пинцетом и скальпелем. Поместите рассеченные резцы в свежий ледяной HBSS.
После вскрытия интересующей ткани поместите рассеченную мягкую ткань в каплю свежего ледяного hbSS в середине 10-сантиметровой чашки Петри, хранящейся на льду. Используя лезвие скальпеля круглой формы No 10, разрежьте ткань на мельчайшие возможные кусочки. После повторной агрегации кусочков ткани в середине капли повторно разрезайте тканевые агрегаты одним и тем же лезвием скальпеля и повторяйте этот процесс до тех пор, пока материал не будет достаточно измельчен.
Переложите измельченные кусочки ткани с помощью одного миллилитра пипетки в предварительно приготовленную смесь для пищеварения. Затем поместите трубку под углом 60 градусов и установите скорость от 150 до 200 оборотов в минуту, чтобы обеспечить постоянные движения подвески внутри трубки, и инкубируйте в течение 15-20 минут. Через каждые три-четыре минуты во время инкубации энергично титруйте суспензию, используя один миллилитровый наконечник пипетки, чтобы разрушить все комки.
В конце инкубации, после титрования клеточной суспензии в последний раз, медленно добавляют ледяной раствор для холодной промывки до конечного объема 12 миллилитров. Центрифугируйте клеточную суспензию в 300 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, а затем осторожно удалите супернатант с помощью 10-миллилитровой серологической пипетки. Повторно суспендировать гранулу в промывочном растворе для достижения конечной концентрации от 700 до 1 200 клеток на микролитр.
Пропустите клеточную суспензию через 50-микрометровый клеточный сетчатый фильтр, чтобы удалить оставшиеся сгустки или кусочки кальцинированной ткани, и держите трубку на льду до дальнейшей обработки. Затем для флуоресцентно-активированной сортировки клеток загрузите ячейки в подготовленную трубку. Загрузите трубку в сортировщик ячеек и установите строгую стратегию удаления клеточного мусора, дублетов и мертвых клеток, как описано в текстовой рукописи.
Во-первых, окрашивание антителом CD45 и последующий анализ FACS были использованы для уточнения количества иммунных клеток в конечной одноклеточной суспензии. В качестве дополнительного метода было проанализировано общее количество CD45-положительных иммунных клеток в данных секвенирования одноклеточной РНК. С помощью FACS было идентифицировано 14,44% CD45 положительных клеток.
Анализ данных секвенирования одноклеточной РНК показал, что 10,9% CD45-экспрессирующих клеток и уменьшение количества клеток в данных секвенирования одноклеточной РНК может быть вызвано дополнительным пороговым значением во время анализа секвенирования. Ключевыми вещами являются быть быстрыми и держать эту ткань или клетки на льду, когда это возможно. Количество изолированных клеток может быть очень низким, особенно во время молярной изоляции мыши.
Избегайте потери клеток. Сокращение времени изоляции одной клетки очень важно для успеха всех одноклеточных экспериментов. И этот специфический метод действительно позволил сократить это время и проложить путь к качественному типу зубных клеток для мышиных и человеческих систем.
