Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Regenerativen Medizin zu beantworten, wie z. B. wo ein menschlicher Zahnfollikel Stammzellen gentechnisch verändert werden könnte, um ihre therapeutischen Eigenschaften zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Stammzellen durch die Einführung von microRNA ohne die Gefahr einer stabilen Genomintegration modifiziert werden können. Beginnen Sie das Verfahren zur enzymatischen Verdauung der beiden Follikel, durch Vorerwärmung auf Raumtemperatur, menschliche Zahnfollikel Stammzelle oder hDFSC Kulturmedium und PBSPSG-Lösung.
Thaw ein aliquot jede von Collagenase Typ I und Dispase II Aktienlösungen. Bereiten Sie eine Verdauungslösung vor, indem Sie 500 Mikroliter der Lagerlösung Kollagenase Typ I und 500 Mikroliter der Dispase II-Lagerlösung auf 4 Milliliter Basal Medium mit 1% Antibiotika enthalten. Um eine Kontamination der Standorte während der menschlichen Zahnfollikel-Stammzellisolation zu vermeiden, müssen Waschpuffer und verwendete Kulturmedien Antibiotika enthalten.
Legen Sie einen extrahierten Zahnfollikel in eine sterile Petrischale. Fügen Sie 10 Milliliter PBSPSG-Lösung hinzu, um das extrahierte Gewebe zu waschen. Aspirieren und entsorgen Sie die Lösung und fügen Sie frische PBSPSG-Lösung hinzu, um die Wäsche zu wiederholen.
Mit einem sterilen Skalpell zerkleinern Sie den extrahierten Follikel in Stücke, wenn etwa 1 mal 1 Millimeter. Das Hackfleisch und die PBSPSG-Lösung aus der Petrischale in ein 50-Milliliter-Konzentrigerohr geben, die Petrischale mit 10 Milliliter PBSPSG-Lösung waschen und in ein und dasselbe Rohr übertragen. Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 353 x g bei Raumtemperatur für zehn Minuten.
5 Milliliter Verdauungslösung in das palettenGewebe geben, die Lösung und das Gewebe vorsichtig mischen, die Mischung bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 in einem Schüttelinkubator für zwei Stunden inkubieren. Nach zwei Stunden zentrifugieren Sie die verdaute Zelle und Gewebesuspension bei 353 g für zehn Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie die erhaltene Palette in 6 MilliliterHDSC-Kulturmedium wieder auf.
Säen Sie die Zellsuspension in einem 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben, und brüten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Nach der Zellernte und Charakterisierung von HDFSC ist wie im Textprotokoll beschrieben, Samen hDFSCs in einer 24 Well-Zell-Kulturplatte. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius, 5% CO2 und 20% Sauerstoff für 24 Stunden.
Am folgenden Tag 40 Picomole von microRNA in 66,7 Mikroliter reduziertem Serummedium verdünnen und die Lösung wirbeln. Verdünnen Sie 0,67 Mikroliter kationisches Lipid-basiertes Transfektionsreagenz in 66,7 Mikroliter reduziertem Serummedium, Wirbel der Lösung und inkubieren Bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Nach fünf Minuten die vorverdünnte microRNA in das vorverdünnte Transfektionsreagenz geben, die Lösung mischen und bei Raumtemperatur 15 Minuten brüten.
Als nächstes fügen Sie die vorbereiteten Transfektionskomplexitäten tropfenweise direkt zum Kulturmedium auf Zellen hinzu. Mischen Sie sanft, indem Sie die 24 Brunnenzellkulturplatte hin und her schaukeln. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden.
24 Stunden nach der Transfektion den Überstand der Proben in den jeweiligen 15 Milliliter-Konifugenrohren sammeln. Waschen Sie die Zellen mit 1 Milliliter PBS und übertragen Sie die PBS in das jeweilige Zentrifugenrohr. Fügen Sie 500 Mikroliter Tropf und EDTA in die Zellen, und brüten die 24 Brunnenplatte bei 37 Grad Celsius, für 3 Minuten.
Beenden Sie die Trypsinisierung, indem Sie 1 Milliliter Zellkulturmedium für die Zellen hinzufügen und die Lösung in das jeweilige Zentrifugenrohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g und 4 Grad Celsius für zehn Minuten. Von hier aus halten Sie die Zellen und Reagenzien auf Eis, sofern nicht anders angegeben.
Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter Neinen Desstrich wieder auf und übertragen Sie die Zelllösung in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie 0,5 Milliliter Amin-Reaktivfarbstoff zu jeder Probe hinzu, um zwischen lebenden und abgestorbenen Zellen zu unterscheiden. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, und brüten bei 4 Grad Celsius für zehn Minuten.
Fügen Sie 1 Milliliter PBS zu den Zellen hinzu, und Zentrifuge bei 300g und 4 Grad Celsius für zehn Minuten Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter PBS wieder auf, fügen Sie 33 Mikroliter Paraformaldehyd hinzu und mischen Sie die Lösungen, speichern Sie die Proben bei 4 Grad Celsius, geschützt vor Licht, bis zytometrische Messungen durch den Fluss. Übertragen Sie die Proben in Röhren, die für zytometrische Durchflussmessungen geeignet sind, und führen Sie die Durchflusszytometrie mithilfe der im Textprotokoll beschriebenen Gating-Strategie durch. Die isolierten menschlichen Zahnfollikelstammzellen zeigten alle für die Definition mesenchymaler Stromalzellen beschriebenen Eigenschaften, Zellen waren kunststoffhaft und zeigten eine Glasfaser-ähnliche Morphologie unter Standardkulturbedingungen.
Die zytometrische Analyse des Flusses ergab, dass hDFSCs ein Panel mit bestimmten Oberflächenantigenen exprimiert haben, einschließlich CD29, CD44, CD73, CD90 und CD105. Während CD45 und CD117 fehlten. Die adipogenen, osteogenen und chondrogenen Differenzierungspotenziale von Zellen unter spezifischen In-Vitro-Kulturbedingungen wurden durch Immunfärbung, ein Fettsäure-Bindendes Protein für:Osteocalcin und Aggrecan, bestätigt.
Die Gating-Strategie für die Quantifizierung der Zytotoxizität und Cy3 markiert microRNA Aufnahme Effizienz 24 Stunden nach der Transfektion, bestätigte microRNA Aufnahme in 100% der lebensfähigen Zellen. Vergleichbare Mengen abgestorbener Zellen in transfizierten und untransfizierten Proben deuten darauf hin, dass microRNA effizient ohne zytotoxische Wirkungen eingeführt wird. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Transdifferenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Cytolab Plastizität zu beantworten.
