Этот метод позволит генерировать трехмерные гистологические изображения из образцов малого миллиметрового масштаба, в том числе малых модельных организмов. Основным преимуществом этого метода является то, что встроенные образцы очень стабильны, что позволяет хранить образцы в течение длительных периодов времени и изображения их несколько раз, скажем, с различными методами визуализации на протяжении многих лет. Выход этого метода будет весьма полезен для высокой пропускной способности модели системы феномики, токсикологии, и, возможно, даже человеческой ткани диагностики.
Как правило, лица, новые для этого метода будет бороться, потому что образцы являются относительно небольшими и трудно ориентироваться или маневрировать. Визуальная демонстрация имеет решающее значение, поскольку необходимо внимание, чтобы избежать повреждения образца. Для несовершеннолетних или пожилых зебры, голодать их, по крайней мере 24 часов, с тем чтобы уменьшить объем содержимого кишечника до фиксации.
Переместите 10%нейтральный буфер формалин или NBF и 2x Tricaine-S предварительно охлажденный до четырех градусов по Цельсию на лед. Удвоить объем рыбной воды с охлажденным 2x MS-222 для быстрой и гуманной эвтаназии. Шестьдесят секунд после того, как рыбы перестали двигаться, после гуманной эвтаназии, поместите рыбу в охлажденный 10%NBF раствор в плоскодонные стеклянные флаконы при комнатной температуре, и исправить их на ночь.
На второй день, промыть фиксированные образцы рыбы три раза в 1x PBS рН 7,4 в течение 10 минут каждый. После мытья, погрузить образцы в 35% этанола и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре с нежным возбуждением. Затем повторите этот шаг с 50% этанола.
Инкубировать образцы в свежеприготовленных 0,3%фосфосфотунграмовой кислоты или PTA раствор на ночь при комнатной температуре с нежным возбуждением, чтобы испачкать их. Начните третий день с подготовки один-к-одному объем за объемом смеси 100% этанола и LR белой акриловой смолы. Промыть образцы три раза в 70% этанола в течение 10 минут каждый, а затем инкубировать образцы в 90% этанола при комнатной температуре в течение 30 минут с нежным возбуждением.
Повторите инкубацию при тех же условиях, но 95% этанола, а затем еще два раза со 100% этанола. В конце, погрузить образцы в один-к-одному этанола и LR белой акриловой смолы смеси, и инкубировать при комнатной температуре на ночь с нежным возбуждением. На четвертый день, удалить смесь из флакона, и добавить 100% LR белой смолы для погружения образцов.
Инкубировать в течение двух часов при комнатной температуре с нежным возбуждением. Через два часа замените смолу свежей 100%-ной белой смолой и инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре с нежным возбуждением. Для сборки встраиваемого аппарата используйте полиМИ труб диаметром не менее 0,1 миллиметра, больше диаметра образца, и разрежьте его до стандартной длины 30 миллиметров.
Затем прикрепите головку микротупы P1000 к белому концу встраиваемого адаптера и вставьте поли MI трубки к его узкому концу. После того, как образцы инкубировали в течение одного часа в 100%LR белой смолы, передать их в небольшой лодке весят и полностью погрузить их в 100%LR белой смолы. Цель трубки встраивания аппарата на широком конце фиксированной образца, или к голове, и трубчатый образец медленно в трубы.
Распоить образец в середине трубки, убедившись, что трубки выше и ниже образца заполнены смолой. Сразу же после этого, чтобы запечатать открытый конец трубки, сгладить кусок масляной мягкой глины моделирования в лист около одного миллиметра толщиной и стабилизировать трубки между указательным и средним пальцами. Затем медленно прижимать глину к концу трубки большим пальцем, и удалить излишки глины.
Снимите встраиваемый аппарат с микротупочной головки. Вытяните трубки нежным вращением. Держа палец против запечатанного конца, чтобы предотвратить выброс глины, запечатать другой конец, медленно толкая распечатанный конец труб в глину.
Поместите трубку горизонтально на трубчатую стойку и дайте смоле полимеризуться в течение 24 часов при температуре 65 градусов по Цельсию в духовке. В конце следующего дня соберите образцы для получения изображений. Успешно встроенные личинки зебры не имеет пузырьков воздуха в ловушке.
Если воздух находится в ловушке в процессе встраивания, он может двигаться в сторону образца, если образец не помещается горизонтально во время полимеризации, что может ухудшить качество изображения. Этот протокол был успешным в внедрении различных модельных организмов. Такие как зебрафиш, Дрозофила, Дафния и эмбрион мыши.
Успешное встраивание может быть показано с реконструированной, 3D визуализации, изображенные микро-КТ для зебры, Дафнии и Дрозофилы. Встраивание смолы можно увидеть во всех сканирований за пределами образца, но не мешает сам образец. Эти образцы могут храниться в течение длительного периода времени и повторно использоваться для нескольких сеансов визуализации, как показано на рисунке личинки зебры рыбы, изображенной в 2011 году.
А потом снова в 2013 году. Анатомические особенности сохраняются после хранения, как видно на крупным планом мышц от обоих сканирований. Кроме того, профили интенсивности нормализуются до соответствующих средних показателей по сегментированным линиям, показывают пространственно соответствующие локальные пики в обоих сканирований.
Средние значения интенсивности для отдельных областей в обоих сканирований были разделены на среднее для фона и использовались для генерации соотношения сигнала к шуму, что хорошо соответствовало между сканированием. При попытке этого метода, важно работать осторожно, чтобы избежать повреждения образца и работать тщательно, чтобы предотвратить введение пузырьков воздуха. После этой процедуры, другие методы, такие как гистология или электронная микроскопия могут быть использованы для того, чтобы изучить модели экспрессии белка, или достичь более высокого разрешения регионов, представляющих интерес в 2D.
Мы надеемся, что эта публикация поможет вам получить доступ к силе микроКТ тканей высокого разрешения.
