Cette méthode vous permettra de générer des images histologiques tridimensionnelles à partir de petits échantillons à l’échelle millimétrique, y compris de petits organismes modèles. Le principal avantage de cette technique est que les échantillons intégrés sont très stables, vous permettant de garder les échantillons pendant de longues périodes de temps et de les imager plusieurs fois, par exemple avec différentes méthodes d’imagerie au fil des ans. La sortie de cette méthode sera très utile pour la phénomie du système de modèle à haut débit, la toxicologie, et potentiellement même le diagnostic des tissus humains.
En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal parce que les échantillons sont relativement petits et difficiles à orienter ou à manœuvrer. La démonstration visuelle est essentielle parce que l’attention est nécessaire pour éviter les dommages à l’échantillon. Pour les poissons zèbres juvéniles ou plus âgés, les affamer pendant au moins 24 heures afin de réduire le volume de contenu intestinal avant la fixation.
Déplacez la formaline tampon neutre de 10 % ou NBF et le 2x Tricaine-S pré-refroidi à quatre degrés Celsius sur la glace. Doublez le volume d’eau de poisson avec le 2x MS-222 réfrigéré pour une euthanasie rapide et humaine. Soixante secondes après que les poissons ont cessé de bouger, après l’euthanasie sans cruauté, placez le poisson dans la solution réfrigérée de 10% NBF dans des flacons de verre à fond plat à température ambiante, et fixez-les pendant la nuit.
Le deuxième jour, rincer les spécimens de poisson fixes trois fois en 1x PBS pH 7,4 pendant 10 minutes chacun. Après le lavage, submerger les échantillons dans 35% d’éthanol et incuber pendant 20 minutes à température ambiante avec une agitation douce. Répétez ensuite cette étape avec 50% d’éthanol.
Incuber les échantillons dans de l’acide phosphotungsten fraîchement préparé ou de la solution PTA pendant la nuit à température ambiante avec une légère agitation pour les tacher. Commencez la troisième journée en préparant un mélange volume par volume de 100 % d’éthanol et de résine acrylique blanche LR. Rincer les échantillons trois fois dans 70% d’éthanol pendant 10 minutes chacun, puis incuber les échantillons dans 90% d’éthanol à température ambiante pendant 30 minutes avec une agitation douce.
Répétez l’incubation dans les mêmes conditions, mais 95% d’éthanol, puis deux fois de plus avec 100% d’éthanol. À la fin, submergez les échantillons dans un mélange d’éthanol et de résine acrylique blanc LR, et incubez à température ambiante pendant la nuit avec une légère agitation. Le quatrième jour, retirer le mélange du flacon et ajouter de la résine blanche 100% LR pour submerger les échantillons.
Incuber pendant deux heures à température ambiante avec une légère agitation. Après deux heures, remplacer la résine par de la résine blanche fraîche 100% LR, et incuber pendant une heure à température ambiante avec une légère agitation. Pour assembler l’appareil d’intégration, utilisez le tube poly MI d’un diamètre d’au moins 0,1 millimètre supérieur au diamètre de l’échantillon et coupez-le à une longueur standard de 30 millimètres.
Attachez ensuite une tête de micro-tuyau P1000 à l’extrémité blanche de l’adaptateur d’intégration et insérez le tube poly MI à son extrémité étroite. Une fois que les échantillons ont incubé pendant une heure en résine blanche 100% LR, transférez-les sur un petit bateau de peseur et submergez-les complètement en résine blanche 100% LR. Visez le tube de l’appareil d’intégration à l’extrémité large de l’échantillon fixe, ou vers la tête, et pipet le spécimen lentement dans le tube.
Placez l’échantillon au milieu du tube, en vous assurant que le tube au-dessus et au-dessous du spécimen est rempli de résine. Immédiatement après, pour sceller l’extrémité ouverte du tube, aplatissez un morceau d’argile douce à base d’huile dans une feuille d’environ un millimètre d’épaisseur et stabilisez le tube entre l’index et les doigts du milieu. Puis appuyez lentement sur l’argile contre l’extrémité du tube avec le pouce, et enlever tout excès d’argile.
Retirez l’appareil d’intégration de la tête du micro-tuyau. Retirez le tube par rotation douce. Tout en tenant un doigt contre l’extrémité scellée pour empêcher l’éjection de l’argile, sceller l’autre extrémité en poussant lentement l’extrémité non scellée du tube dans l’argile.
Placez le tube horizontalement sur une grille à tube et laissez la résine polymériser pendant 24 heures à 65 degrés Celsius dans le four. À la fin du lendemain, prélevez les échantillons pour l’acquisition d’images. Une larve de poisson zèbre intégrée avec succès n’a pas de bulles d’air piégées.
Si l’air est emprisonné pendant le processus d’intégration, il peut se déplacer vers le spécimen si l’échantillon n’est pas placé horizontalement pendant la polymérisation, ce qui peut dégrader la qualité de l’image. Ce protocole a réussi à intégrer divers organismes modèles. Comme le poisson zèbre, la drosophile, la daphnie et l’embryon de souris.
L’intégration réussie peut être montrée avec des rendus 3D reconstruits, photographiés par balayage de micro-CT pour zebrafish, Daphnia, et Drosophila. La résine d’intégration peut être vue dans tous les balayages à l’extérieur de l’échantillon, mais n’interfère pas avec l’échantillon lui-même. Ces spécimens peuvent être stockés pendant une longue période de temps et réutilisés pour plusieurs séances d’imagerie, comme le montre la larve de poisson zèbre photographiée en 2011.
Et puis à nouveau en 2013. Les caractéristiques anatomiques sont conservées après le stockage, comme on le voit sur les gros plan des muscles des deux scans. En outre, les profils d’intensité normalisés à leurs moyennes correspondantes le long des lignes segmentées, montre spatialement correspondant pics locaux dans les deux scans.
Les valeurs moyennes d’intensité pour certaines régions des deux scans ont été divisées par une moyenne pour l’arrière-plan et utilisées pour générer des rapports signal-bruit, ce qui correspondait bien entre les balayages. Tout en essayant cette méthode, il est important de travailler doucement pour éviter les dommages à l’échantillon et de travailler avec soin pour empêcher l’introduction de bulles d’air. Suivant cette procédure, d’autres méthodes telles que l’histologie ou la microscopie électronique peuvent être utilisées afin d’étudier les modèles d’expression des protéines, ou d’obtenir une résolution plus élevée des régions d’intérêt en 2D.
Nous espérons que cette publication vous aidera à accéder à la puissance du micro-CT tissulaire haute résolution.
