この方法により、小さなモデル生物を含む小さいミリメートルスケールのサンプルから3次元の組織学的画像を生成することができます。この手法の主な利点は、組み込みサンプルが非常に安定しており、サンプルを長期間保持し、それらを複数回画像化できるようにすることです。この方法の出力は、高スループットモデルシステムフェノミクス、毒物学、さらにはヒト組織診断にも非常に有用です。
一般的に、この方法に新しい個人は、サンプルが比較的小さく、配向または操縦が困難であるため、苦労します。サンプルの損傷を避けるために注意が必要であるため、視覚的なデモンストレーションが重要です。若年性または古いゼブラフィッシュの場合は、固定前に腸の含有量の量を減らすために、少なくとも24時間飢えさせる。
10%中性バッファーホルマリンまたはNBFと2xトリケーヌ-Sを氷の上に4°Cに予め冷やします。急速かつ人道的な安楽死のために冷やされた2倍のMS-222で魚の水量を倍増します。魚が動かなくなった60秒後、人道的安楽死の後、魚を室温で平底ガラスバイアルに冷やした10%NBF溶液に入れ、一晩固定する。
2日目には、1x PBS pH 7.4で固定魚片をそれぞれ10分間3回すすいでください。洗浄後、35%エタノールにサンプルを水没させ、穏やかな攪拌で室温で20分間インキュベートします。その後、このステップを50%エタノールで繰り返します。
サンプルを調製したばかりの0.3%ホスホトゥングステン酸またはPTA溶液を室温で一晩、穏やかな攪拌でインキュベートして染色します。3日目は、100%エタノールとLR白色アクリル樹脂の1対1の体積ごとの混合物を調製して開始します。サンプルを70%エタノールでそれぞれ10分間3回リンスし、室温で90%エタノールでサンプルを穏やかな攪拌で30分間インキュベートします。
同じ条件でインキュベーションを繰り返しますが、95%エタノールを、さらに2回100%エタノールで繰り返します。最後に、1対1のエタノールとLR白色アクリル樹脂混合物にサンプルを水没させ、穏やかな攪拌で一晩室温でインキュベートする。4日目に、バイアルから混合物を取り出し、サンプルを水没させるために100%LR白色樹脂を加える。
穏やかな攪拌で室温で2時間インキュベートします。2時間後、フレッシュ100%LR白樹脂で樹脂を交換し、穏やかな攪拌で室温で1時間インキュベートします。埋め込み装置を組み立てるには、試料の直径より少なくとも0.1ミリメートル大きいポリMIチューブを使用し、標準長30ミリメートルに切断する。
次に、P1000 マイクロパイプヘッドを埋め込みアダプタの白い端に取り付け、ポリ MI チューブをその狭い端に挿入します。サンプルを100%LR白樹脂で1時間インキュベートした後、小さな重量を量るボートに移し、100%LR白樹脂に完全に沈めます。固定サンプルの広い端で埋め込み装置のチューブを目指し、または頭部に向かって、試験体をチューブにゆっくりと配管に配管する。
サンプルをチューブの中央に配置し、標本の上下のチューブが樹脂で満たされていることを確認します。その直後に、チューブの開いた端を密封し、油性軟調なモデリング粘土を厚さ約1ミリメートルのシートに平らにし、人差し指と中指の間の管を安定させる。その後、ゆっくりと親指でチューブの端に粘土を押し付け、余分な粘土を取り除きます。
マイクロパイプヘッドから埋め込み装置を取り外します。優しい回転でチューブを引き出します。粘土の噴出を防ぐために密閉された端に指を持ちながら、密閉されていないチューブの端をゆっくりと粘土に押し込み、もう一方の端を密封します。
チューブラックの上にチューブを水平に置き、樹脂をオーブンで摂氏65度で24時間重合させます。翌日の終わりに、画像取得用のサンプルを収集します。正常に埋め込まれたゼブラフィッシュの幼虫は、閉じ込められた気泡を持っていません。
埋め込みプロセス中に空気が閉じ込められた場合、重合中にサンプルが水平に配置されないと、試料に向かって移動し、画質が低下する可能性があります。このプロトコルは、様々なモデル生物を埋め込むことに成功しました。例えばゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、ダフニア、マウス胚など。
成功した埋め込みは、ゼブラフィッシュ、ダフニア、ショウジョウバエのマイクロCTスキャンで画像化された再構築された3Dレンダリングで示すことができます。埋め込み樹脂は、サンプル外のすべてのスキャンで見ることができますが、サンプル自体に干渉しません。これらの標本は、2011年に画像化されたゼブラフィッシュ幼虫で示すように、長期間保存し、複数のイメージングセッションに再利用することができます。
そして2013年に再び。解剖学的特徴は両方のスキャンからの筋肉のクローズアップで見られるように、貯蔵の後に保存される。さらに、強度プロファイルは、セグメント化された線に沿って対応する平均に正規化され、両方のスキャンで空間的に一致する局所ピークを示す。
両方のスキャンで選択した領域の平均強度値をバックグラウンドの平均で割り、スキャン間でうまく一致する信号対雑音比を生成するために使用されました。この方法を試みている間、サンプルの損傷を避け、気泡の導入を防ぐために慎重に働くために穏やかに働くことを重要です。この手順に従って、蛋白質発現のパターンを研究したり、2Dで関心領域の分解能を高くするために、構造学や電子顕微鏡などの他の方法を用いることができる。
私たちの希望は、この出版物は、あなたが高解像度の組織マイクロCTの力にアクセスするのに役立つことを願っています。
