هذه الطريقة سوف تمكنك من توليد صور الهاتولوجية ثلاثية الأبعاد من عينات صغيرة من المليمتر، بما في ذلك الكائنات الحية الصغيرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن العينات المضمنة مستقرة للغاية ، مما يمكنك من الاحتفاظ بالعينات لفترات طويلة من الزمن وتصويرها عدة مرات ، لنقل مع طرق تصوير مختلفة على مر السنين. وسيكون الناتج من هذه الطريقة مفيدة للغاية لارتفاع الإنتاجية نموذج نظام الفينومات، وعلم السموم، وربما حتى تشخيص الأنسجة البشرية.
عموما سوف الأفراد الجدد لهذا الأسلوب النضال لأن العينات صغيرة نسبيا ويصعب توجيه أو المناورة. العرض التوضيحي المرئي أمر بالغ الأهمية لأن الاهتمام مطلوب لتجنب تلف العينة. بالنسبة للأحداث أو كبار السن من الحمار الوحشي ، تجويعهم لمدة 24 ساعة على الأقل من أجل تقليل حجم محتوى الأمعاء قبل التثبيت.
نقل 10٪ عازلة محايدة formalin أو NBF و 2x Tricaine-S مبردة مسبقا إلى أربع درجات مئوية على الجليد. مضاعفة حجم المياه السمكية مع المبردة 2X MS-222 للقتل الرحيم السريع والإنساني. بعد ستين ثانية من توقف الأسماك عن الحركة ، بعد القتل الرحيم الإنساني ، ضع الأسماك في محلول NBF المبرد بنسبة 10٪في قوارير زجاجية مسطحة القاع في درجة حرارة الغرفة ، وإصلاحها بين عشية وضحاها.
في اليوم الثاني، شطف عينات الأسماك الثابتة ثلاث مرات في 1x PBS pH 7.4 لمدة 10 دقائق لكل من. بعد الغسيل، غمر العينات في 35٪ الإيثانول واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التحريض لطيف. ثم كرر هذه الخطوة مع 50٪ الإيثانول.
احتضان العينات في إعداد حديثا 0.3٪ حمض فوسفوتونغستن أو حل PTA بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع التحريض لطيف لطخة لهم. تبدأ اليوم الثالث من خلال إعداد واحد إلى واحد حجم من قبل حجم خليط من 100٪ الإيثانول وLR راتنج الاكريليك الأبيض. شطف العينات ثلاث مرات في 70٪ الإيثانول لمدة 10 دقائق لكل من، ثم احتضان العينات في 90٪ الإيثانول في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع التحريض لطيف.
كرر الحضانة تحت نفس الظروف ولكن 95٪ الإيثانول ثم مرتين مع 100٪ الإيثانول. في النهاية، غمر العينات في واحد إلى واحد الإيثانول وLR خليط راتنج الاكريليك الأبيض، واحتضان في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها مع التحريض لطيف. في اليوم الرابع، وإزالة الخليط من القارورة، وإضافة 100٪ LR الراتنج الأبيض لغمر العينات.
احتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع التحريض لطيف. بعد ساعتين، استبدل الراتنج بالراتنج الأبيض الطازج بنسبة 100٪ LR، واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات اللطيفة. لتجميع جهاز التضمين، استخدم أنابيب بولي MI بقطر لا يقل عن 0.1 ملليمتر أكبر من قطر العينة، وقم بقصه إلى طول قياسي يبلغ 30 ملليمتراً.
ثم قم بتوصيل رأس الأنابيب الدقيقة P1000 إلى الطرف الأبيض للمحول المضمّن وأدخل أنابيب بولي MI إلى نهايتها الضيقة. بعد أن حضنت العينات لمدة ساعة واحدة في 100٪ LR الراتنج الأبيض، ونقلها إلى قارب صغير يزن وغمرها بالكامل في 100٪ LR الراتنج الأبيض. تهدف أنابيب الجهاز تضمين في نهاية واسعة من العينة الثابتة، أو نحو الرأس، و pipet العينة ببطء في الأنابيب.
ضع العينة في منتصف الأنابيب ، مع التأكد من أن الأنابيب فوق العينة وتحتها مليئة بالراتنج. مباشرة بعد, لختم نهاية مفتوحة من أنابيب, تسطيح قطعة من الطين لينة النفط القائم على النمذجة في ورقة حوالي ملليمتر واحد سميكة وتثبيت الأنابيب بين مؤشر والأصابع الوسطى. ثم اضغط ببطء على الطين ضد نهاية الأنابيب مع الإبهام، وإزالة أي الطين الزائد.
إزالة الجهاز تضمين من رأس الأنابيب الدقيقة. سحب الأنابيب عن طريق تناوب لطيف. في حين عقد إصبع ضد نهاية مختومة لمنع طرد الطين، وختم الطرف الآخر عن طريق دفع ببطء نهاية غير مختومة من الأنابيب في الطين.
ضع الأنابيب أفقياً على رف أنبوب، واسمح للراتنج بالمبلمرة لمدة 24 ساعة عند 65 درجة مئوية في الفرن. في نهاية اليوم التالي، جمع العينات للحصول على صورة. يرقات حمار وحشي مضمّنة بنجاح ليس لديها فقاعات هوائية محاصرة.
إذا كان الهواء محاصرا أثناء عملية التضمين، فإنه يمكن أن تتحرك نحو العينة إذا لم يتم وضع العينة أفقيا أثناء البلمرة، والتي يمكن أن تحط من جودة الصورة. وقد نجح هذا البروتوكول في تضمين مختلف الكائنات الحية النموذجية. مثل الحمار الوحشي، دروسوفيليا، دافنيا، والجنين الماوس.
يمكن إظهار التضمين الناجح مع الاداءات ثلاثية الأبعاد ، التي تم تصويرها بواسطة المسح الضوئي المجهري للحمار الوحشي ، دافنيا ، ودروسوروسفيليا. ويمكن رؤية الراتنج التضمين في جميع عمليات المسح خارج العينة، ولكن لا تتداخل مع العينة نفسها. ويمكن تخزين هذه العينات لفترة طويلة من الزمن وإعادة استخدامها لجلسات تصوير متعددة، كما هو مبين مع صورة يرقات الحمار الوحشي في عام 2011.
ثم مرة أخرى في عام 2013. يتم الحفاظ على الميزات التشريحية بعد التخزين ، كما هو الحال في الصور المقربة للعضلات من كلا الفحصين. وعلاوة على ذلك، فإن ملامح الكثافة التي تم تطبيعها مع المتوسطات المقابلة لها على طول الخطوط المجزأة، تظهر القمم المحلية المتطابقة مكانياً في كلا المسحين.
تم تقسيم متوسط قيم الكثافة لمناطق مختارة في كلا المسحين على متوسط للخلفية واستخدمت لتوليد نسب الإشارة إلى الضوضاء ، والتي تتوافق جيدًا بين عمليات المسح. أثناء محاولة هذه الطريقة، من المهم العمل بلطف لتجنب تلف العينة والعمل بعناية لمنع إدخال فقاعات الهواء. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل علم الأنسجة أو المجهر الإلكتروني من أجل دراسة أنماط التعبير البروتيني، أو تحقيق دقة أعلى للمناطق ذات الاهتمام في 2D.
نأمل أن هذا المنشور سوف تساعدك على الوصول إلى قوة عالية الدقة الأنسجة الدقيقة CT.
