Bu yöntem, küçük model organizmalar da dahil olmak üzere küçük milimetre ölçekli örneklerden üç boyutlu histolojik görüntüler oluşturmanızı sağlayacaktır. Bu tekniğin en büyük avantajı, gömülü örneklerin çok kararlı olması, örnekleri uzun süre tutmanızı ve yıllar boyunca farklı görüntüleme yöntemleriyle bunları birden fazla kez görüntülemenizi sağlar. Bu yöntemin çıktısı yüksek verim modeli sistem fenomik, toksikoloji ve hatta potansiyel olarak insan doku tanısı için son derece yararlı olacaktır.
Örnekler nispeten küçük ve yönlendirmek veya manevra zor olduğu için genellikle bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek. Örnek hasarı önlemek için dikkat gerektiğinden görsel gösteri çok önemlidir. Genç veya yaşlı zebra balıkları için, fiksasyon dan önce bağırsak içeriğinin hacmini azaltmak için en az 24 saat aç.
%10 nötr tampon formalin veya NBF ve 2x Tricaine-S önceden soğutulmuş dört derece santigrat buz üzerine taşıyın. Hızlı ve insancıl ötenazi için soğutulmuş 2x MS-222 ile balık suyu hacmini iki katına çıkarın. Balık hareket durdu ktan altmış saniye sonra, insancıl ötenazi sonra, oda sıcaklığında düz dipli cam şişeler soğutulmuş% 10 NBF çözeltisi balık yerleştirin ve bir gecede onları düzeltmek.
İkinci gün, sabit balık örneklerini 1x PBS pH 7.4'te üç kez 10'şar dakika boyunca durulayın. Yıkadıktan sonra numuneleri %35 etanolle batırın ve oda sıcaklığında hafif ajitasyonla 20 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra% 50 etanol ile bu adımı tekrarlayın.
Taze hazırlanmış% 0.3 fosfotungsten asit veya PTA çözeltisi gece oda sıcaklığında nazik ajitasyon ile onları leke örnekleri kuluçka. Üçüncü güne %100 etanol ve LR beyaz akrilik resin karışımını bire bir hacim olarak hazırlayarak başlayın. Örnekleri her biri 10 dakika boyunca %70 etanolde üç kez durulayın, ardından numuneleri oda sıcaklığında %90 etanolle 30 dakika boyunca nazik ajitasyonla kuluçkaya yatırın.
Aynı koşullar altında kuluçka tekrarlayın ama% 95 etanol ve daha sonra iki kez daha fazla% 100 etanol ile. Sonunda, bire bir etanol ve LR beyaz akrilik resin karışımı örnekleri batırın ve nazik ajitasyon ile gece oda sıcaklığında kuluçka. Dördüncü gün, şişeden karışımı çıkarın ve örnekleri batırmak için% 100 LR beyaz reçineler ekleyin.
Oda sıcaklığında iki saat boyunca hafif ajitasyon ile kuluçkaya yat. İki saat sonra, resenin yerine taze %100 LR beyaz reciye koyun ve oda sıcaklığında bir saat boyunca hafif ajitasyon la kuluçkaya yatırın. Gömme cihazını monte etmek için, numunenin çapından en az 0,1 milimetre daha büyük bir çapa sahip poli MI borusu kullanın ve 30 milimetrelik standart uzunluğa kesin.
Daha sonra katıştırma adaptörün beyaz ucuna bir P1000 mikro boru kafası takın ve poli MI borusunu dar ucuna takın. Örnekler %100 LR beyaz reçinede bir saat kuluçkaya yattıktan sonra, onları küçük bir tartı teknesine aktarın ve %100 LR beyaz reçineye batırın. Gömme cihazının borusunu sabit numunenin geniş ucundaveya başın anına doğru nişan alın ve numuneyi yavaşça boruya doğru boruya yerleştirin.
Numuneyi tüpün ortasına yerleştirin ve numunenin üstündeki ve altındaki boruların rekarn le dolu olduğundan emin olun. Hemen sonra, boru açık ucunu mühürlemek için, yaklaşık bir milimetre kalınlığında bir levha içine yağ bazlı yumuşak modelleme kil bir parça düzleştirmek ve indeks ve orta parmaklar arasındaki boru stabilize. Sonra yavaş yavaş başparmak ile boru ucuna karşı kil basın ve herhangi bir fazla kil kaldırın.
Gömme aparatını mikro-boru başlığından çıkarın. Boruyu hafif bir dönüşle çekin. Kilin atılmasını önlemek için mühürlü uca bir parmak tutarken, borunun mühürsüz ucunu yavaşça çamura doğru iterek diğer ucunu kapatın.
Tüpü yatay olarak bir tüp rafa yerleştirin ve reçinin fırında 65 derecede 24 saat polimerize olmasını bekleyin. Ertesi günün sonunda, görüntü edinimi için örnekleri toplayın. Başarılı bir şekilde gömülü bir zebra balığı larvası hiçbir hava kabarcıkları tuzak vardır.
Gömme işlemi sırasında hava sıkışıp kalırsa, numune polimerizasyon sırasında yatay olarak yerleştirilmezse numuneye doğru hareket edebilir ve bu da görüntü kalitesini düşürebilir. Bu protokol çeşitli model organizmaları gömmede başarılı oldu. Zebra balığı, Drosophila, Daphnia ve fare embriyosu gibi.
Başarılı gömme yeniden gösterilebilir, 3D render, zebra balığı için mikro-CT tarama ile görüntülenebilir, Daphnia, ve Drosophila. Gömme reşin numune dışındaki tüm taramalarda görülebilir, ancak numunenin kendisine müdahale etmez. Bu numuneler uzun bir süre saklanabilir ve 2011 yılında görüntülenen zebra balığı larvası ile gösterildiği gibi birden fazla görüntüleme seansı için yeniden kullanılabilir.
Ve 2013'te tekrar. Anatomik özellikler depolamadan sonra korunur, her iki taramadan kasların yakın çekimlerinde görüldüğü gibi. Ayrıca, yoğunluk profilleri parçalı çizgiler boyunca karşılık gelen ortalamalara normalleştirilmiş, her iki taramada da mekansal olarak eşleşen yerel zirveleri gösterir.
Her iki taramada seçilen bölgelerin ortalama yoğunluk değerleri arka plan ortalamasına bölündü ve taramalar arasında iyi karşılık gelen sinyal-gürültü oranları oluşturmak için kullanıldı. Bu yöntemi denerken, numune hasarını önlemek ve hava kabarcıklarının girişini önlemek için dikkatli çalışmak için nazikçe çalışmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, histoloji veya elektron mikroskobu gibi diğer yöntemler protein ekspresyonu kalıplarını incelemek veya 2D ilgi bölgelerinin daha yüksek çözünürlük elde etmek için kullanılabilir.
Umudumuz, bu yayının yüksek çözünürlüklü doku mikro-BT gücüne erişmenize yardımcı olmasıdır.
