Этот метод может помочь решить вопросы, связанные с эффективностью, выходом восстановления и чистотой бронхоальвеолярной жидкости лаважа, полученной внеклеточными пузырьками с использованием подхода к центрифугации ультрафильтрации. Мы напрямую сравнили этот метод с методом ультрацентрифугации и градиентной очистки плотности. Основным преимуществом этой техники является то, что она проста, эффективна и подходит для небольших объемных образцов, таких как murine bronchoalveolar жидкости лаважа.
Что еще более важно, он обеспечивает высокую чистоту и значительно более высокую масштабируемость по сравнению с методом изоляции ультрацентрифугации. Демонстрацией процедуры будет мистер Норман Гарретт III, научный сотрудник моей лаборатории. Для начала вставьте 22-го калибра ангиокатетера в трахею усыпной мыши.
Прикрепите инсулиновый шприц с одним миллилитром ледяной стерильной DPBS, и привить один миллилитр в обоих легких. Медленно вывести шприц поршень для получения бронхоальвеолярной жидкости лаважа, или BAL жидкости. И обойтись bal жидкости в конической трубки на льду.
После этого вытяните жидкость BAL из 25 мышей и разделите ее на два равных набора. Центрифуга жидкости BAL при 400 раз G в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Соберите супернатант и центрифуга его на 15000 раз G при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Затем соберите супернатант и немедленно приступайте к шагам изоляции EV. Во-первых, фильтровать супер natant через 0,2 микрометра стерильный шприц-фильтр. После этого, equilibrate центробежный блок фильтра с стерильным DPBS в течение 10 минут.
Затем центрифуга центробежной единицы на 15000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию. Заполните фильтр 15 миллилитров жидкости BAL. И центрифуга его на 3000 Г в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию.
После этого, мыть ретентат с 14 миллилитров стерильных DPBS, мягко трубы неоднократно. Центрифуга фильтра при 3000 Г при четырех градусах по Цельсию в течение 30 минут, чтобы удалить DPBS и сконцентрировать ретентат. Для сбора концентрированной жидкости BAL, полученной EV, вставьте пипетку в нижней части фильтра блока, и снять образец с помощью из стороны в сторону радикальных движения.
Затем aliquot BAL жидкости, полученных EV и хранить их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Кроме того, начните с передачи предыдущего приобретенного супернатанта в ультрацентрифугную трубку. И центрифуга при 10 000 Г в течение 30 минут при четырех градусах цельсия.
Затем соберите супернатант и центрифугу. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы EV в 200 микролитров DPBS. После этого смешайте подвеску EV с 300 микролитров 50%iodixanol рабочего решения.
И перенесите его в 15-миллилитровую ультрацентрифугную трубку. Затем добавьте буферное решение в соответствии с текстовым протоколом, чтобы создать градиент плавучей плотности, и центрифуга его на 100 000 G в течение трех часов и 50 минут. Соберите 15% и 25%iodixanol фракций, и разбавить их в DPBS довести объем до 15 миллилитров.
Перенесите фракции в новую ультрацентрифугную трубку и центрифугу при 100 000 Г при четырех градусах цельсия в течение 60 минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы EV в 50 микролитров стерильных DPBS. Чтобы начать анализ отслеживания наночастиц, разбавьте образец EV в один миллилитр DPBS.
И загрузите образец в инсулиновый шприц. После этого прикрепите шприц к шприц-насосу и измерьте количество и размер частиц. Установите уровень камеры до 14 и порог обнаружения до одного.
Далее используйте считыватель пластин для количественной оценки количества белка в образце EV с помощью колоритного обнаружения. Растворите равное количество белка EV из каждого образца с помощью буфера загрузки и DTT. Затем нагревать образцы при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
Загрузите образцы в акриламидный гель Bis-Tris Plus и запустите электрофорез в течение 35 минут. Затем перенесите белки в мембрану нитроцеллюлозы с помощью метода сухого переноса. После этого заблокив мембрану пятипроцентным обезжиренным молоком в течение 60 минут с нежным раскачиванием.
Инкубировать мембрану с антителом к маркеру белка поверхности EV при четырех градусах по Цельсию с нежным качания на ночь. Развивайте мембрану, инкубируя мембрану антителами HRP-соединения в течение 60 минут при комнатной температуре. Вымойте мембрану в течение 10 минут с буфером TBST три раза.
Наконец, разработать мембрану с химилюминесцентными HRP антитела обнаружения реагента, прежде чем приступить к визуализации. Чтобы начать поток цитометрии, разбавить BAL жидкости, полученных EV в 49 микролитров PEB окрашивания буфера. Затем добавьте три антитела к каждому из образцов, прежде чем инкубировать образцы при четырех градусах по Цельсию с качанием в течение 60 минут в темноте.
Наконец, разбавить образцы 40 микролитров мембранного фильтрованного буфера окрашивания PEB и выполнить анализ цитометрии потока. В этом протоколе, EV были изолированы от мыши BAL жидкости с помощью UFC и UC-DGC методов. BAL жидкости, полученных EV от нормальных мышей, изолированных методом UFC отображается меньшие размеры и более равномерное распределение размера, чем UC-DGC-EV's.
Техника UFC также имела значительно более высокое общее количество частиц по сравнению с техникой UC-DGC. Общее восстановление белка измеряется в миллиграммах UFC-EV был также выше, чем у UC-DGC-EV, что свидетельствует о том, что метод UFC больше времени и усилий эффективным. Наконец, жидкость BAL, полученная EV, также была дополнительно охарактеризована с помощью цитометрии потока.
UFC-EV и UC-DGC-EV оба выразили CD63, CD9, и CD81. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы регидратировать мембрану ультрафильтрационного блока с DPBS. После того, как мембрана увлажняется, устройство должно быть влажным в любое время до тех пор, пока используется.
Извлечение внеклеточного ретемента пузырьков из фильтровальной единицы может быть сложной задачей. Убедитесь, что наконечник пипетки прокатилась из стороны в сторону, чтобы восстановить большую часть EV из фильтра блока. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области внеклеточной изоляции пузырьков для изучения биологических функций бронхоалвеолярного лаважа, полученных внеклеточных пузырьков в нормальных или патологических условиях у мелких животных.
