Таким образом, целью метода в нашей рукописи является обеспечение сравнительного анализа сигнальных путей в миелоидных клетках с использованием систем человека и мыши. Это помогает определить, какой сигнальный путь участвует вниз по течению от выбранных рецепторов распознавания образов. Так что этот метод прост в реализации.
Он опирается на первичные клеточные препараты и проверенные справочные соединения, что имеет важное значение для выяснения сигнальных механизмов. Демонстрация процедуры будет Ратиба Туил и Аделина Unterreiner, соответственно ученый и научный сотрудник в нашей группе. В ламинарный капюшон изымаются стерильные ножницы, стакан с одним литром и полиэтиленовый пакет.
Поместите ранее полученные баффи пальто в стакан и использовать ножницы, чтобы тщательно открыть его. Используя 25 мм пипетку добавить 100 мл PBS дополняется 2 миллимоляра EDTA. Смешайте медленно трубопроводов вверх и вниз.
А затем передать 25 мл разбавленной баффи пальто в шесть 50 мл конической центрифуги трубки, которые были предварительно заполнены с 15 мл полисахарида на основе градиента плотности. Центрифуга труб в течение 20 минут при 800 г с умеренным ускорением без перерыва, чтобы обеспечить разделение клеток на основе их плотности. После центрифугации будут видны три слоя: гранулы, содержащие красные кровяные тельца и гранулоциты, верхний слой из плазмы и белое кольцо, содержащее периферические моноядерные клетки крови.
Используйте 10 мл пипетки для сбора колец PBMC и передать их в новую трубку 50 мл. Пополнить с PBS и EDTA. Выполните три последовательных стирки с уменьшением времени центрифугации и скорости, как указано в текстовом протоколе.
После окончательного мытья, повторно гранулы в 25 мл ледяного лиза буфера, чтобы подлизить красные кровяные тельца осмотического давления. Инкубировать раствор при комнатной температуре, пока не станет ясно. Затем добавьте 25 мл буфера разделения, чтобы остановить реакцию.
Центрифуга при 150 г в течение восьми минут для мытья раствора. Слейте супернатант и повторно подвесной гранулы с буфером разделения. После подсчета клеток, разбавить их в культуре среды до 12500 клеток на колодец.
Распространение 30 мл этой клеточной подвески в каждом хорошо 384 хорошо пластины. Затем добавьте 15 микролитров четырехконцентрированных составных растворов к каждой из них и например пластины при 37 градусах Цельсия с 5%углекислым газом в течение одного часа. При желании добавьте либо LPS в окончательную концентрацию 1 нг на мл, либо обедненный зимозан до конечной концентрации 100 мкг на мл.
Затем инкубировать пластину на ночь при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. На следующий день возьмите 10 микролитров супернатанта для измерения секретных альфа-уровней TNF. Чтобы начать серийное разбавление, разбавить MLT-827 фондовый раствор со средним для достижения концентрации 8 микромоляров за один раз.
Выполните шестишаговое серийное разбавление 1:5 с использованием среды с 0,08%DMSO. Чтобы подготовиться к разовой дозе испытаний, разбавить MLT-827, AFN700, и соединения 11 фондовых решений со средним для достижения концентрации 4 микромолара на одном ходу. Во-первых, добавьте 2 мл стерильной воды без эндотоксина в 10 мг обедненного зимозана.
Vortex это решение фонда, чтобы гомогенизировать его. Aliquot решение, а затем хранить aliquots при 20 градусов по Цельсию. В этом исследовании человеческие ПХМС и клетки селезенки мыши стимулируются либо истощенным зимосаном, агонистом Dectin-1, либо липополисахаридом, агонистом TL4.
Альфа-релиз NTNF в супернатанте измеряется через 20 часов. Как в человеке, так и в мышином анализе соединение MLT-827 избирательно блокирует альфа-производство TNF, движимое путем Dectin-1, но не путем TLR4. В моноцитах, стимулируемых LPS, производство альфа TNF почти полностью отменено AFN700, но оно не чувствительно к Cpd11, что согласуется с зависимостью пути TLR4 от активности NF-kappa B и его независимостью от активности SIC.
В отличие от TNF альфа-производства, управляемого Dectin-1 и MODCs показывает чувствительность к MLT-827, AFN700, и Cpd11. Это дает дополнительные доказательства участия каскада сигнальных сигналов SIC CBM в пути Dectin-1. Производство бета-версии Ил-1, Ил-6 и Ил-23 также чувствительно к трем ингибиторам, что указывает на регулятивные механизмы, аналогичные альфа-TNF.
Однако ограниченное влияние на производство Ил-8 говорит о том, что этот цитокин имеет отдельный механизм регулирования. Повышение концентрации трехалозы-дибехената выше 50 мкг на мл приводит к выработке альфа TNF, IL-6 и бета-версии IL-1, которые полагались на активность паракаспазы MALT1 в соответствии с блокирующим эффектом MLT-827. Аналогичные результаты были замечены при оспаривании MODCs с увеличением концентрации истощенных зимозан для стимулирования Dectin-1.
Этот метод позволяет показать, что паракаспаса MALT1 избирательно регулирует C-тип лектин-как рецептор сигнализации. Необходимо использовать хорошо характерные справочные соединения. Обратите внимание на процедуру разбавления фондовых растворов.
Это имеет решающее значение для соединения с ограниченной solubility.
