Настоящий протокол может служить новой платформой для изучения и разработки носителей лекарств для нацеливания на участки заболеваний в сосудистой системе человека. Основным преимуществом нашей методики является то, что она позволяет изучать накопление носителей лекарств внутри реплицированной человеком 3d артериальной модели. Это делается в физиологических условиях, включая кровоток.
Такой подход может быть использован для оптимизации носителей лекарств для диагностики и лечения широкого спектра сосудистых заболеваний, в том числе атеросклеротических артерий. Начните с выбора изображений пациентов или ранее изученной геометрии бифуркации сонной артерии человека и использования изображений для создания автоматизированной модели проектирования формы. Используйте 3D-принтер для печати дизайна, удалите временные печатные опоры и промойте модель ацетоном перед использованием наждачной карты для полировки и сглаживания форм, особенно областей, из которых были вырезаны опоры.
После шлифования промойте модель изопропиловым спиртом, чтобы удалить пластиковую пыль и дать модели высохнуть в химической вытяжке в течение двух-трех часов. Чтобы облегчить разочарование в пластике, трижды опрыскиваете модель прозрачным лаком, позволяя лаку высыхать на воздухе в течение одного часа между применениями. После последнего нанесения используйте кисть и лак для приклеивания прозрачных, прямоугольных полосок гладкого пластика к каждой стороне рамы, так что модель будет герметизирована снизу и открыта сверху.
После высыхания поместите форму в осушитель и медленно плохо приготовленный свежеприготовленный раствор силиконовой резины в отверстие. Удалите пузырьки воздуха до тех пор, пока смесь не очистится, и оставьте плесень внутри адсорбцика на ночь. Когда смесь полностью высохнет, удалите прозрачные слайды и погрузите модель в абсолютный ацетон на 48 часов в химическую вытяжку, пока пластик полностью не растворится.
Чтобы испарить захваченный ацетон перед посевом клеток, инкубируйте модель в течение не менее четырех дней при 60 градусах Цельсия. Чтобы засеять модель ячейками, сначала стерилизуйте модель и два впускных и выпускных разъема ультрафиолетовым светом или излучением. Через 20 минут с помощью шприца покрывают модель четырьмя миллилитрами по 100 мкг на миллилитр фибронектина в течение двух часов при 37 градусах Цельсия.
В конце инкубации удаляют раствор фибронектина через выходное отверстие и промывают модель средой эндотелиальных клеток. Используйте шприц для заполнения промытой модели четырьмя миллилитрами от 2,5 раз 10 до шестых эндотелиальных клеток на миллилитр клеточной суспензии эндотелиальной клеточной среды и закрепите модель на ротаторе внутри инкубатора клеточной культуры 48 часов при одном обороте в минуту, чтобы обеспечить однородное распределение клеток. В конце инкубации используйте пластиковый шприц объемом 10 миллилитров для мытья модели с PBS.
Зафиксируйте ячейки в течение 15 минут, с четырьмя миллилитрами 4% параформальдегида, затем трижды промыть модель PBS, как показано, прежде чем хранить модель при четырех градусах Цельсия в четырех миллилитрах свежего PBS. Прежде чем начать эксперимент, используйте выпускную трубку для подключения амортизатора колебаний, подключенного к перистальтическому насосу, к входу культивируемой модели сонной артерии и используйте кусок трубки для слияния двух выходов. Затем разделите выпускную трубку на две выпускные трубки и добавьте пластиковый зажим к каждой трубке.
Чтобы настроить конфигурацию замкнутого контура, добавьте 300 миллилитров PBS в контейнер с замкнутым контуром и поместите одну впускную и одну выпускную трубку внутри заполненного PBS контейнера с открытыми зажимами B и C соответственно, затем поместите другую впускную трубку в однолитровую мотирочную емкость, заполненную дистиллированной водой, а другую выпускную трубку в пустой однолитровой контейнер для отходов с закрытыми зажимами A и D, соответственно. Поместите модель сонной артерии под стереомикроскоп, установите насос на начальную скорость потока 10 оборотов в минуту, с увеличением пяти оборотов в минуту каждые четыре-пять минут. Когда скорость потока достигнет 100 оборотов в минуту, добавьте 1,6 микрограмма флуоресцентных карбоксилированных частиц полистирола на миллилитр PBS в контейнер замкнутого контура и изобразите интересующей область каждые 10 секунд в течение полутора часов.
Чтобы настроить конфигурацию разомкнутого контура, откройте зажимы A и D и немедленно закройте зажимы B и C. Пусть большая часть воды течет из моечного контейнера в контейнер для отходов со скоростью 100 оборотов в минуту. Прежде чем вода будет полностью передана, остановите насос и закройте зажимы трубок до входа и после выхода модели сонной артерии.
Используя соответствующие фильтры, захватывайте изображения модели в интересуемой области, чтобы показать осаждение и адгезию частиц к ячейкам. По завершении эксперимента используйте настраиваемый программный код для анализа изображений, снятых в интересуемой области, введите название изображения и установите расчетный порог. Затем запустите код.
Проверьте полученное изображение и подсчитанные количества частиц на изображении. В этом репрезентативном анализе фотофотографии культивируемых эндотелиальных клеток, посеянных в 3D-модели сонной артерии, можно наблюдать с помощью ярко-поля и флуоресцентной конфокальной микроскопической визуализации. Флуоресцентные стеклянные шарики диаметром 10 микрон, засеянные в 3D-модель, продемонстрировали схему рециркуляции, предполагающую успешную имитацию физиологических условий в модели.
Визуализация осаждения частиц показала, что более высокий уровень адгезии частиц к клеткам наблюдался за пределами области рециркуляции, где напряжение сдвига стенки было высоким. Следуя этому протоколу, функционализированные частицы со специфической кинетикой связывания и основной культурой клеток в различных моделях артерий человека могут быть изучены для улучшения модели и изучения конкретных составов. Эта методика обеспечивает новую платформу для изучения сосудистого таргетирования носителей лекарств.
Недавно мы использовали его, чтобы показать, как аддитивность частиц может быть адаптирована для нацеливания на различные больные области сосудов.
