Этот метод может помочь прояснить спинномозговых механизмов, лежащих в основе сенсорной передачи, ноцицептивной регуляции и хронической боли или боли развития Основное преимущество этой техники является то, что он может позволить идеальное сохранение нейронов и он может имитировать условия in-vivo в определенной степени. Начните с вытягивать записывая электроды от borosilicate микрокапилляров стекла используя шкив капилляра. Затем заполните форму расплавленным агаром, чтобы подготовить 1,2 сантиметра на 1,5 сантиметра на 2,0 сантиметра агар-блока.
Обрезать блок, чтобы иметь центральный канал при планировании поперечных разделов. Или плоть канала с краем блока для парасагитальных секций. До извлечения транскардиального изобилия и спинного мозга приготовьте 500 миллилитров сахарозы на основе ACSF.
Охладить раствор для ледяного холода и эквилибрата с 95%O2 и 5%CO2. Охладить все инструменты вскрытия на льду. Сделайте продольный пятиметровый разрез на задней коже от каудала до рострального.
Затем прорезать грудную клетку между позвоночником и ребрами с обеих сторон. Используйте ножницы, чтобы сделать разрез на хвостовом конце позвоночника. Затем отрежьте окружающие ткани и быстро изолируйте люмбосакальный сегмент позвоночника.
Перенесите люмбосакальный сегмент в стеклянное блюдо, содержащее ледяную сахарозу на основе ACSF. С брюшной стороны вверх, использовать тонкие ножницы, чтобы прорезать позвоночные pedicle двусторонне и подвергать спинного мозга тщательно. Изолировать двухметровый участок спинного мозга с люмбосакальным расширением и перенести спинномозговую секцию в другое стеклянное блюдо, наполненное холодной сахарозой ACSF.
Работа под микроскопом вскрытия, чтобы удалить оболочек и пиа арахноидной мембраны. Отрежьте все вентраальные и спинные корни как можно быстрее. Позаботьтесь, чтобы избежать травм спинного мозга, особенно спинной рог при удалении околивания и спинного мозга.
Поместите спинной мозг на ранее подстриженный агар-блок. Чтобы подготовить поперечные ломтики, приложите брюшной стороне спинного мозга к агару с спинной стороны к лезвию. Чтобы подготовить паразагиттальные ломтики, прикрепите вентальную сторону суперклеем к агару в вертикальном направлении.
Затем смонтировать агар блок на платформу виброма с суперклеем. И подготовить от 300 до 500 микрон поперечных или паразагиттальных ломтиков с продвинутой скоростью 0,025 миллиметра в секунду и частотой вибрации 80 Герц. Спинной мозг должен быть нарезаны дорсо-вентралько.
Для получения наилучших результатов, ломтик должен быть подготовлен в течение 15 до 20 минут. Толщина ломтика позвоночника должна быть не более 600 микрон, чтобы удовлетворить видимость клеток. Используйте пластиковую подстриженную пипету для переноса ломтиков на нейлоновую сетку в камере хранения, содержащей непрерывно оксигенированный ACSF при 32 градусах по Цельсию.
Для проведения цельноклеточного патча зажим записи из субстантии желатинозы или SG нейронов, использовать ион калия на основе внутриклеточных решений для записи при применении цезия катиона на основе раствора только для записи ингибирующие пост-синаптические токи. Аккуратно переместите кусочек спинного мозга в камеру записи. А затем стабилизировать его твердо с U формы платиновой проволоки с нейлоновыми нитями для оптимальной стабильности ломтик.
Устойчиво обильное ломтик с пузырьками ACSF при комнатной температуре и установить скорость изобилия на два-четыре миллилитров в минуту для достижения достаточной оксигенации. Затем, используя объектив микроскопа низкого разрешения, определите область нейронов SG как полупрозрачную полосу. Выберите здоровый нейрон, характеризующийся трехмерной формой с яркой и гладкой мембраной в качестве целевой клетки, используя цель высокого разрешения, и отрегулируйте ее к центру экрана видеоконтокона.
Заполните микро-пипетку соответствующим объемом ионов калия на основе или ионов цезия на основе внутриклеточного раствора. Затем вставьте микро-пипетку в держатель электрода и убедитесь, что внутриклеточный раствор соприкасается с серебряной проволокой внутри держателя. Принесите микро пипетки в фокус и использовать микроманипулятор, чтобы погрузить его в ACSF.
Применить мягкое положительное давление, чтобы заставить от любой грязи и мусора. Постепенно переместив микро трубу к целевому нейрону. Как только пипетка приближается к нейрону и образуется очень маленькая ямочка на нейрональной мембране, отпустите положительное давление, чтобы сформировать гигазем.
Измените потенциал холдинга до минус 70 милливольт, что близко к физиологическому мембранному потенциалу клетки. Затем нанесите переходный и нежный всасывание на микро трубу, чтобы разорвать мембрану и создать хорошую конфигурацию цельных клеток. Запись стрельбы свойства путем тестирования стрельбы шаблон каждого нейрона в текущем зажим с серией одной секунды деполяризации тока импульсов от 25 до 150 пикоамперов с 25 пикоамп шагом на отдых мембраны потенциал.
Для записи соматических субтресковых токов удерживайте мембранный потенциал на уровне минус 50 милливольт в режиме зажима напряжения, затем применяем серию гиперполяризующих импульсов напряжения продолжительностью от минус 60 милливольт до минус 120 милливольт с 10-миллиметровым декрементом. Запись возбудительных пост-синаптических течений с ионной ионной основе калия внутриклеточного раствора в режиме зажима напряжения при удерживательном потенциале минус 70 милливольт. Запись IPSC использует цезий ионный ионный внутриклеточный раствор для записи IPSC's.
После проведения мембранного потенциала на уровне минус 70 милливольт в течение примерно пяти минут, постепенно меняем потенциал холдинга до нуля милливольт. Подождите несколько минут для стабилизации, а затем начать записывать события IPSC. Схемы стрельбы, определяемые путем введения серии одной секунды деполяризации тока импульсов в нейрон SG на отдых мембраны потенциал может быть классифицирована как тонизирующее стрельбы, задержки стрельбы, разрыв стрельбы, первоначальный взрыв, фазический разрыв, один шип и неохотно стрельбы.
На этом изображении показан вызывающий протокол для подтресхолдингов тока в зажиме напряжения. Эти репрезентативные следы показывают реакцию на гиперполяризацию текущей инъекции, классифицируемой как IH, IA и IT. Это репрезентативный след SEPSC, записанный от SG нейронов на уровне минус 70 милливольт при отсутствии и наличии 50 микромоляров APV и 20 микромоляров CN'X. Этот след показывает записанные SEPC до добавления APV и CN'X на расширенной шкале времени.
После этой процедуры являются методы, такие как парные записи патч зажима или оптогенетики могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, как характеристика конкретных нейрональных микрокругов в substantia gelatinosa.
