이 방법은 감각 전염, 출혈 조절 및 만성 통증 또는 통증 발달의 기본 척추 메커니즘을 명확히하는 데 도움이 될 수 있으며,이 기술의 주요 장점은 이상적인 신경 보존을 허용 할 수 있으며 생체 내 조건을 어느 정도 모방 할 수 있다는 것입니다. 모세관 풀러를 사용하여 보로실리케이트 유리 미세 모세 혈관에서 기록 전극을 당겨 서 시작합니다. 그런 다음 몰드를 용융 한천으로 채우고 1.2 센티미터에서 1.5 센티미터를 2.0 센티미터 의 천막 블록으로 준비하십시오.
가로 섹션을 계획하는 경우 블록을 중앙 채널을 갖도록 트림합니다. 또는 기생 절개블록의 가장자리가 있는 채널 살. 경질 증혈 및 척수 추출에 앞서 500밀리리터의 자당 기반 ACSF를 준비하십시오.
얼음 추위에 대한 용액을 식히고 95%O2 및 5%CO2로 균형을 이룬다. 얼음에 있는 모든 해부 도구를 식힙니다. 코달에서 장밋빛까지 뒤쪽 피부에 세로 5센티미터 절개를 합니다.
그런 다음 양쪽의 척추와 갈비뼈 사이의 갈비뼈를 잘라냅니다. 가위를 사용하여 척추의 caudal 끝에서 절단하십시오. 그런 다음 주변 조직을 잘라 내고 척추의 요추 를 신속하게 분리합니다.
요추를 얼음 차가운 자당 기반 ACSF가 함유된 유리 접시에 옮춥시다. 복부 쪽을 위쪽으로, 양면으로 척추 페디클을 잘라 조심스럽게 척수를 노출하기 위하여 미세한 가위를 사용하십시오. 척수의 2센티미터 길이 부분을 요추 확대로 분리하고 척추 부위를 차가운 자당 ACSF로 채워진 다른 유리 접시로 옮깁니다.
수막과 피아 거미막을 제거하기 위해 해부 현미경으로 작동합니다. 모든 복부와 등대 뿌리를 가능한 한 빨리 잘라냅니다. 수막과 척추 뿌리를 제거할 때 척수, 특히 등경에 부상을 피하십시오.
이전에 손질된 한천 블록에 척수를 놓습니다. 횡방향 슬라이스를 준비하려면 척수의 복부 면을 등쪽이 칼날을 향해 한천에 부착합니다. 기생 조각을 준비하려면 복부 면을 수퍼 접착제로 천지에 수직 방향으로 부착합니다.
그런 다음, 초접착제와 진동의 플랫폼에 천 블록을 마운트. 또한 300~500마이크로론 횡단 또는 기생슬라이스를 초당 0.025밀리미터의 고급 속도와 80 헤르츠의 진동 주파수로 준비한다. 척수는 등구를 심창적으로 슬라이스해야합니다.
최상의 결과를 얻으려면 슬라이스를 15~20분 이내에 준비해야 합니다. 척추 슬라이스의 두께는 세포 가시성을 만족시키기 위해 600 미크론을 초과해서는 안됩니다. 플라스틱 트리밍 파이펫을 사용하여 32도에서 지속적으로 산소를 공급받는 저장 챔버에서 나일론 메쉬로 슬라이스를 전달합니다.
실질적인 젤라틴사 또는 SG 뉴런으로부터 전세포 패치 클램프 레코딩을 수행하려면, 시냅스 후 전류의 레코딩을 위해서만 카이슘 양이온 기반 용액을 적용하는 동안 기록용 세포내 용액을 기반으로 칼륨 이온을 사용하십시오. 척수 슬라이스를 녹음실로 부드럽게 이동합니다. 그런 다음 최적의 슬라이스 안정성을 위해 나일론 실이있는 U 자형 플래티넘 와이어로 단단히 안정화하십시오.
꾸준히 실온에서 거품 ACSF와 슬라이스를 profuse하고 충분한 산소를 달성하기 위해 분당 2 ~ 4 밀리리터로 풍부 속도를 설정합니다. 그런 다음 저해상도 현미경 렌즈를 사용하여 반투명 밴드로서 SG 뉴런 영역을 식별합니다. 고해상도 목표를 사용하여 표적 세포로서 밝고 매끄러운 멤브레인이 있는 3차원 형상을 특징으로 하는 건강한 뉴런을 선택하고 비디오 모니터 화면의 중심으로 조정한다.
마이크로 파이펫을 적절한 양의 칼륨 이온을 기반으로 하거나 세포내 용액을 기반으로 하는 카이슘 이온을 채웁니다. 그런 다음 마이크로 파이펫을 전극 홀더에 삽입하고 세포 내 용액이 홀더 내부의 실버 와이어에 접촉하고 있는지 확인합니다. 마이크로 파이펫을 초점으로 가져와 마이크로 조작기를 사용하여 ACSF에 담가 둡니다.
가벼운 양압을 적용하여 먼지와 이물질을 강제로 제거합니다. 점차적으로 표적 뉴런쪽으로 마이크로 파이펫을 이동합니다. 파이펫이 뉴런과 뉴런 멤브레인에 매우 작은 보조개 형태에 도달하면 양압을 방출하여 기가실을 형성합니다.
세포의 생리적 휴식 막 잠재력에 가까운 마이너스 70 밀리볼트에 보유 잠재력을 변경합니다. 그런 다음 마이크로 파이펫에 일시적이고 부드러운 흡입을 적용하여 멤브레인을 파열시키고 좋은 전체 세포 구성을 만듭니다. 현 클램프에서 각 뉴런의 발사 패턴을 테스트하여 25~150개의 피코앰프를 25~150개의 피코암과 함께 현 클램프의 각 뉴런의 발사 패턴을 테스트하여 25개의 피코암증증을 증분하여 현막 전위전위에서 발사 특성을 기록한다.
체세포 하위 임계값 전류를 기록하려면 전압 클램프 모드에서 멤브레인 전위를 마이너스 50 밀리볼트로 유지한 다음 1초 지속 시간의 초극광 전압 펄스를 마이너스 60 밀리볼트에서 10밀리볼트 감소로 마이너스 120밀리볼트로 적용합니다. 마이너스 70 밀리볼트의 보유 잠재력에서 전압 클램프 모드에서 세포내 용액을 기반으로 칼륨 이온을 기반으로 하는 흥분 후 전류를 기록합니다. IPSC의 기록을 위한 세포내 용액을 기반으로 한 세슘 이온을 사용하여 IPSC를 기록하십시오.
약 5 분 동안 마이너스 70 밀리볼트에서 멤브레인 잠재력을 유지 한 후 점차적으로 유지 잠재력을 0 밀리볼트로 변경합니다. 안정화를 위해 몇 분 간 기다린 다음 IPSC 이벤트를 기록하기 시작합니다. 휴식 막 잠재력에서 SG 뉴런에 1초 의 탈극화 전류 펄스를 연이어 주입하여 결정된 발사 패턴은 강장제 발사, 지연 발사, 갭 발사, 초기 버스트, 단계파열, 단일 스파이크 및 마지 못해발사로 분류될 수 있다.
이 이미지는 전압 클램프의 하위 임계값 전류에 대한 호출 프로토콜을 보여 주어 있습니다. 이러한 대표적인 추적은 IH, IA 및 IT로 분류된 과극화 전류 주입에 대한 반응을 보여줍니다. 이것은 50 마이크로 몰러 APV및 20 마이크로 몰러 CNQX의 부재 와 존재에 마이너스 70 밀리볼트에서 SG 뉴런에서 기록 된 SEPSC의 대표적인 흔적이다. 이 추적은 확장된 기간에 APV 및 CNQX를 추가하기 전에 기록된 SEPC를 보여줍니다.
이 절차에 따라 페어링 된 패치 클램프 기록 또는 광유전학과 같은 방법은 실질적인 젤라틴에 특정 뉴런 미세 회로를 특성화하는 것과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다.
