Questo metodo può aiutare a chiarire i meccanismi spinali alla base della trasmissione sensoriale, della regolazione nocicettiva e dello sviluppo cronico del dolore o del dolore Il principale vantaggio di questa tecnica è che può consentire la conservazione neuronale ideale e può imitare le condizioni in vivo in una certa misura. Iniziare tirando elettrodi di registrazione da microcapillari di vetro borosilicato utilizzando un estrattore capillare. Quindi, riempire uno stampo con agar fuso per preparare un blocco di agar di 1,2 centimetri per 1,5 centimetri per 2,0 centimetri.
Tagliare il blocco per avere un canale centrale se si pianificano sezioni trasversali. O una carne di canale con il bordo del blocco per le sezioni parasagittali. Prima della profusione trascardica e dell'estrazione del midollo spinale, preparare 500 millilitri di ACSF a base di saccarosio.
Raffreddare la soluzione per raffreddare il ghiaccio ed equilibrare con il 95%O2 e il 5%CO2. Raffreddare tutti gli strumenti di dissezione sul ghiaccio. Fai un'incisione longitudinale di cinque centimetri sulla pelle posteriore dal caudale al rostrale.
Quindi, tagliare la gabbia toracica tra la colonna vertebrale e le costole su entrambi i lati. Usa le forbici per fare un taglio all'estremità caudale della colonna vertebrale. Quindi tagliare i tessuti circostanti e isolare rapidamente il segmento lumbosacrale della colonna vertebrale.
Trasferire il segmento lumbosacrale in un piatto di vetro contenente saccarosio freddo ghiacciato a base di ACSF. Con il lato ventrale verso l'alto, utilizzare forbici fini per tagliare bilateralmente il pedicolo vertebrale ed esporre attentamente il midollo spinale. Isolare una sezione del midollo spinale lunga due centimetri con l'ingrandimento lumbosacrale e trasferire la sezione spinale in un altro piatto di vetro riempito con saccarosio freddo ACSF.
Lavorare al microscopio a dissezione per rimuovere le meningi e la membrana pia aracnoide. Tagliare tutte le radici ventrali e dorsali il più rapidamente possibile. Fare attenzione ad evitare il lesionee al midollo spinale, in particolare il corno dorsale quando si rimuovono le meningi e le radici spinali.
Posizionare il midollo spinale sul blocco di agar tagliato in precedenza. Per preparare fette trasversali, attaccare il lato ventrale del midollo spinale all'agar con il lato dorsale verso la lama. Per preparare fette parasagittali, attaccare il lato ventrale con supercolla all'agar in direzione verticale.
Quindi, montare il blocco di agar su una piattaforma di un vibratomo con supercolla. E preparare fette trasversali o parasagittali da 300 a 500 micron con una velocità avanzata di 0,025 millimetri al secondo e una frequenza di vibrazione di 80 Hertz. Il midollo spinale deve essere tagliato dorso-ventrally.
Per ottenere i migliori risultati, la fetta deve essere preparata entro 15-20 minuti. Lo spessore della fetta spinale non deve essere superiore a 600 micron per soddisfare la visibilità cellulare. Utilizzare una pipetta rifilata in plastica per trasferire le fette su rete di nylon in una camera di stoccaggio contenente ACSF ossigenato continuamente a 32 gradi Celsius.
Per condurre registrazioni di patch patch a cellule intere da neuroni substantia gelatinosa o SG, utilizzare soluzioni intracellulari a base di ioni di potassio per la registrazione durante l'applicazione di soluzione a base di cesio solo per la registrazione di correnti post-sinaptiche inibitorie. Spostare delicatamente la fetta del midollo spinale nella camera di registrazione. E poi stabilizzarlo saldamente con un filo di platino a forma di U con fili di nylon per una stabilità ottimale delle fette.
Abbondantemente la fetta con ACSF bolleto a temperatura ambiente e impostare la velocità di profusione a due o quattro millilitri al minuto per ottenere una sufficiente ossigenazione. Quindi, usando una lente al microscopio a bassa risoluzione, identificare la regione dei neuroni SG come una banda traslucida. Scegli un neurone sano, caratterizzato da una forma tridimensionale con una membrana luminosa e liscia come cellula bersaglio utilizzando l'obiettivo ad alta risoluzione e regolalo al centro dello schermo del monitor video.
Riempire una micro pipetta con un volume appropriato di soluzione intracellulare a base di ioni di potassio o di cesio. Quindi inserire la micro-pipetta nel supporto dell'elettrodo e assicurarsi che la soluzione intracellulare contatti il filo d'argento all'interno del supporto. Mettere a fuoco la micro pipetta e utilizzare il micromanipolatore per immergerla nell'ACSF.
Applicare una leggera pressione positiva per forzare lo sporco e i detriti. Spostare gradualmente la micro pipetta verso il neurone mirato. Una volta che la pipetta si avvicina al neurone e si forma una fossetta molto piccola sulla membrana neuronale, rilasciare la pressione positiva per formare un gigaseale.
Alterare il potenziale di detenzione a meno 70 millivolt, che è vicino al fisiologico potenziale di membrana a riposo di una cellula. Quindi, applicare un'aspirazione transitoria e delicata alla micro pipetta per rompono la membrana e creare una buona configurazione a celle intere. Registra le proprietà di cottura testando il modello di attivazione di ogni neurone nel morsetto di corrente con una serie di un secondo di impulsi di corrente depolarizzante da 25 a 150 picoamp con incrementi di 25 picoamp al potenziale della membrana a riposo.
Per registrare le correnti subreshold somatiche, mantenere il potenziale della membrana a meno 50 millivolt in modalità morsetto di tensione, quindi applicare una serie di impulsi di tensione iperpolarizzanti di una seconda durata da meno 60 millivolt a meno 120 millivolt con un decremento di 10 millivolt. Registrare le correnti post-sinaptiche eccitatorie con la soluzione intracellulare a base di ioni di potassio in modalità morsetto di tensione ad un potenziale di tenuta di meno 70 millivolt. Registrare IPSC utilizzando una soluzione intracellulare basata sugli ioni di cesio per la registrazione di IPSC.
Dopo aver tenuto il potenziale della membrana a meno 70 millivolt per circa cinque minuti, cambiare gradualmente il potenziale di tenuta a zero millivolt. Attendere alcuni minuti per la stabilizzazione, quindi iniziare a registrare gli eventi IPSC. I modelli di cottura determinati iniettando una serie di impulsi di corrente depolarizzanti di un secondo in un neurone SG a potenziale di membrana a riposo possono essere classificati come tonico-firing, ritardato-firing, gap-firing, initial-burst, phasic-bursting, single-spike e reluctant-firing.
Questa immagine mostra il protocollo evocante per le correnti di sottosoglie nel morsetto di tensione. Queste tracce rappresentative mostrano la risposta all'iniezione di corrente iperpolarizzante classificata come IH, IA e IT. Questa è una traccia rappresentativa di SEPSC registrata dai neuroni SG a meno 70 millivolt in assenza e presenza di 50 micromolari APV e 20 micromolare CNQX. Questa traccia mostra i SEPC registrati prima dell'aggiunta di APV e CNQX su una scala cronologica espansa.
Seguendo questa procedura sono i metodi come le registrazioni di patch clamp accoppiate o l'optogenetica può essere eseguita per rispondere a domande aggiuntive come caratterizzare specifici microcircuiti neuronali in substantia gelatinosa.
