Впервые мы представили iSCAT в 2004 году в контексте обнаружения и спектроскопии наночастиц золота. В последующие 10 лет мы разработали этот метод для обнаружения и отслеживания биологических наночастиц, таких как вирусы и небольшие белки. Суть метода заключается в том, что любой материальный объект, каким бы малым он ни был, имеет конечное сечение вымирания.
Основным преимуществом этого метода является обнаружение без этикеток. Это означает, что если мы достаточно чувствительны, мы можем обнаружить почти все, как белки или экзосомы, выделяется из одиночных клеток. Вопрос, который нужно быть осторожным о том, как относиться к рассеянию фона.
Большим преимуществом микроскопа iSCAT является то, что он может быть полностью построен дома и может быть добавлен в существующий коммерческий микроскоп. Это означает, что его можно легко сочетать с другими оптическими методами, такими как флуоресценция, и это одна из причин того, что многие группы также в настоящее время используют iSCAT и связанные с ним методы. Здесь мы используем клетки ЛУЗ в качестве образцовой системы, чтобы показать обнаружение отдельных и секреторных белков.
Тем не менее, этот метод может быть также применен для зондирования практически любого биологического процесса на молекулярном уровне. Для достижения стабильного микроскопа, начните с замоченного оптического стола и жесткого массивного блока для стадии образца. Создайте этап выборки микроскопа, который включает в себя высокую цель численной диафрагмы и единицу перевода, которая позволяет для бокового перевода выборки, а также изменения положения фокусировки для цели.
Используйте 45-градусное вертикальное креатурное зеркало и 50-сантиметровый фокусный одномерный объектив, чтобы сфокусировать свет диодного лазера на длине волны 445 нанометров на заднюю фокусную плоскость цели. Этот широкий полевой объектив создает коллимированный луч в центре внимания цели, который станет источником освещения iSCAT. Нанесите капельку масла погружения на цель и поместите стеклянную крышку в образец плоскости стадии микроскопа.
Это приведет к пучка, который отражает обратно вниз через изображение цели. Чтобы настроить траекторию изображения, введи противоразумие покрытием beamsplitter под углом 45 градусов по отношению к лучу инцидента и примерно 10 сантиметров после широкоугольной линзы. Убедитесь, что антирефлексивное покрытие указывает на лазерный источник.
Обратите внимание, как толстый beamsplitter введет значительное смещение пучка, так что лазер не может войти в цель прямо больше. При необходимости перестроить путь лазерного луча перед beamsplitter обеспечить правильное распространение через цель. Чтобы убедиться, что образец плоскости и камеры являются парфокальные, начните с размещения вогнутый объектив с отрицательным фокусным расстоянием 45 сантиметров в положении пять сантиметров после широкого поля объектива в пути луча инцидента.
Это приведет к коллимированному лучу, входя в заднюю диафрагму цели. С экраном, помещенным в отражающую руку интерферометра, переместите цель в вертикальном направлении, чтобы найти грубое фокусное положение. Цель находится в фокусе, когда луч удара экрана коллимирован.
Удалите как отрицательный фокусный объектив, так и экран при грубой фокусировке. Добавьте второй 50-сантиметровый фокусный одномерный объектив, чтобы сфокусировать рассеянный свет и коллиматировать отраженный свет. Убедитесь, что объектив находится в 50 сантиметрах от задней фокусной плоскости цели, так что передаваемый лазерный луч снова коллимируется.
Для завершения сборки установки iSCAT поместите камеру CMOS на 50 сантиметров от 50-сантиметрового фокусного объектива и распоивите луч прямо на середину чипа. Чтобы настроить дополнительные каналы визуализации, можно урезать выход источника светодиодного света в цель дальнего рабочего расстояния. Установите механические компоненты над камерой образца, которые позволяют фокусировки и бокового позиционирования светодиодной продукции на образец.
Переместите верхнюю цель с боковой стороны так, чтобы цель верхнего широкого поля и нижняя цель iSCAT были колинитарами. Это определяется путем размещения экрана под нижней целью и максимизации интенсивности передаваемого светодиодного света на экране. Теперь поместите 550-нанометровое короткометрическое дихроическое зеркало, чтобы разделить передаваемый светодиодный свет от лазерной траектории iSCAT.
Разделите этот луч на два канала с восемью процентами отражающих, 92 процентов трансмиссивных, beamsplitter. 92-процентный путь является каналом флуоресценции, а восьмипроцентный путь используется для изображения яркого поля. Изображение яркого поля канала на камеру CMOS с помощью пятиметровой фокусной длины ахроматического дублетного объектива.
Изображение канала флуоресценции на отдельной камере CMOS с помощью пятиметрового фокусного объектива achromatic doublet. Кроме того, используйте 600 нанометровый фильтр длинный переход, чтобы заблокировать свет возбуждения. Чтобы настроить компьютер и программное обеспечение, подключите все камеры к компьютеру.
На полностью собранной установке наблюдайте изображение iSCAT на камере CMOS и убедитесь, что оно находится в фокусе, найдя остаточную пыль или частицу грязи на стеклянной крышке. Убедитесь, что изображение частицы является круговой симметричной функцией распространения тока. Функция распространения точки не будет иметь круглую форму, если лазерный луч входит в цель микроскопа под небольшим углом.
Это может быть исправлено путем небольшой корректировки 45-градусного зеркала, чтобы обеспечить прямую связь с целью. Сравните изображения камер яркого поля и флуоресценции каналов. Убедитесь, что оба находятся в фокусе, и отображать ту же область путем изображения флуоресцентных шарик или образец клетки.
Убедитесь, что положение лазера iSCAT находится примерно в центре изображения, и обратите внимание на его положение для более поздней ссылки. Чтобы изменить положение и поле зрения яркого поля и канала флуоресценции, перемести камеры на стол по отношению к фокусировке линз. Подготовка к эксперименту, как описано в текстовом протоколе.
Это включает в себя подготовку клеток и микроскопии среды, а также микроскоп образца cuvette. Убедитесь, что лазерный луч заблокирован, чтобы предотвратить клетки от непосредственного воздействия лазерного света iSCAT. Ввимите приблизительно 3 microliters подготовленного образца клетки немножко с центра в cuvette образца.
Аккуратно коснитесь наконечника пипетки к крышке и медленно ввесните клеточный раствор. Позвольте клеткам осесть на крышке. Проверьте количество ячеек, близких к лазеру iSCAT.
Если количество ячеек слишком низкое, повторите этот шаг до тех пор, пока не будет доступно достаточное количество. Если покрытие клеток слишком плотное, используйте инъекцию примерно 20 микролитров дополнительной микроскопии среды для разгона клеток через крышку. Используя этап пьезоэлектрического перевода, переместив образец с боковой стороны, чтобы распоить ячейку близко к поле зрения iSCAT.
Убедитесь, что ячейка не входит в поле зрения iSCAT, так как прямое воздействие 445 нанометрового лазерного света может быть вредным для клетки. Разблокировать лазерный луч iSCAT и убедитесь, что поверхность крышки все еще находится в фокусе. Приложите изоляционный стол, чтобы свести к минимуму дрейф и акустические связи с окружающей средой.
Начните измерение с получения изображений с камер iSCAT, brightfield и флуоресценции. Периодически проверяйте жизнеспособность ячейки и направленность системы. Здесь для отображения изображений камер используется программное обеспечение для самостоятельного микроскопа.
Здесь дифференциальная визуализация выполняется в режиме реального времени путем вычитания последовательных кадров, чтобы сделать белковые привязки видимыми. Это приводит к фильтрации изображения, которое видно на экране вместе с необработанным изображением камеры. Здесь показаны репрезентативные результаты эксперимента по клеточной секреции, проведенного с помощью iSCAT.
На видео показаны выделения ячейки ЛАЗ в течение двух минут. Дифференциальные изображения iSCAT слева визуализировать поглощение отдельных белков в стекло. Яркие изображения и флуоресцентный канал справа используются для мониторинга жизнеспособности клеток.
Эта гистограмма показывает обнаруженные белки и их контрастность в течение этого двухминутного периода времени. Данные были собраны путем анализа отдельных обязательных событий в каждом кадре видео данных iSCAT с помощью пользовательского алгоритма поиска пика. Микроскопия ISCAT является не только мощным инструментом биочувствия, но и микроскопии, поскольку позволяет без маркировки обнаруживать нано-объекты в режиме реального времени.
В частности, он может быть применен к различным процессам, таким как диффузия и транспортировка белков. Благодаря своей изысканной чувствительности к рассеянию света, iSCAT может обнаружить любой белок или сущность в поле зрения. Конечно, это также означает, что метод не хватает специфики, что флуоресценция приносит с собой, но, чтобы обойти этот вопрос, можно применить дополнительные методы, такие как поверхность функционализации для обнаружения конкретных белков, представляющих интерес.
Не забывайте, что работа с лазерами может быть опасной, и соответствующую защиту глаз всегда следует носить при сборке и регулировке микроскопа. Обнаружение секретомов в реальном времени является очень захватывающим и крупным скачком в медицинской диагностике, которая в настоящее время требует гораздо больше времени и очень далека от чувствительности одного белка. Существует еще много возможностей для повышения производительности метода и расширения его применения.
Поэтому мы надеемся, что это видео поможет другим группам присоединиться к этим захватывающим усилиям.
