С помощью массочувствительного отслеживания частиц мы можем наблюдать отдельные биомолекулы, диффундирующие на липидных мембранах, и количественно оценивать их динамику в режиме реального времени, и все это полностью без маркировки. Поскольку никаких этикеток не требуется, нет опасности нарушения динамического поведения биомолекул. Еще одним преимуществом этого метода является его массовая чувствительность, которая позволяет определять мембранно-связанные олигомерные состояния.
Благодаря своей универсальности, мы можем применить этот метод к любой мембранно-ассоциированной системе. В частности, он может быть использован для изучения образования лиганд-индуцированных рецепторных комплексов. Начните с распределения равного количества слайдов микроскопа в держателях PTFE.
Перенесите держатели из PTFE в стаканы. Добавьте сверхчистую воду и обжаривайте их ультразвуком в течение 15 минут при комнатной температуре. Используйте пинцет, чтобы перенести держатели на чистые стаканы и добавить ультрачистый изопропанол.
Снова соник в течение 15 минут, затем снова замените изопропанол сверхчистой водой и обработайте ультразвуком стакан, содержащий держатели, в течение 15 минут. Снимите держатели с стаканов и высушите феном предметные стекла микроскопа в держателе под постоянным потоком газообразного азота или сжатого воздуха. Поместите высушенный держатель, содержащий большие слайды микроскопа, в плазмоочиститель и включите его.
Оберните плоский картон алюминиевой фольгой. Распределите очищенные 24 миллиметра на 24 миллиметра предметные стекла микроскопа на алюминиевой фольге с достаточным расстоянием между собой. Затем прикрепите двусторонние ленточные полоски к верхнему и нижнему краям слайдов.
Иссейте каждый предмет микроскопа скальпелем так, чтобы его можно было извлечь из алюминиевой фольги. Каждый слайд должен иметь полосы двусторонней ленты, прикрепленные к верхнему и нижнему краям слайда. Затем прикрепите слайд двумя двусторонними ленточными полосками к гидрофилизированному слайду.
Это сформирует траекторию потока между меньшими и большими слайдами микроскопа. Разбавляют свежеэкструдированные небольшие одноцветные везикулы, или внедорожники, до конечной концентрации 0,4 миллиграмма на миллилитр в требуемом реакционном буфере. Необязательно, чтобы способствовать разрыву пузырьков, добавьте два миллимоляра хлорида кальция в суспензию везикул.
Установите проточную камеру на ступень массового фотометра. Промывайте 25 микролитров везикулярной суспензии в проточную камеру и инкубируйте камеру в течение двух минут, затем удаляйте несмешанные везикулы путем повторной промывки проточной камеры с 200 микролитрами реакционного буфера каждый раз. Как только липидная мембрана освободится от неслитых везикул, добавьте 50 микролитров интересующего белка в камеру образца.
Затем задайте условия визуализации, такие как размер поля зрения, время экспозиции, частота кадров и время получения в программном обеспечении для сбора данных. Автоматическая настройка фокуса. При необходимости используют боковой контроль для перемещения поля зрения в положение с однородной мембраной.
Создайте папку проекта и начните запись фильма. После завершения записи укажите имя файла в диалоговом окне, запрашиваемом программным обеспечением для приобретения. Фильм будет автоматически сохранен в папку проекта в виде MP-файла для последующего анализа.
Чтобы проанализировать записанные видео, запустите приложение для записной книжки Jupyter. В появившемся списке папок перейдите в папку, в которой выполняется анализ MSPT. ipy файл записной книжки сохраняется и нажмите на файл.
В записных книжках Jupyter код организован в ячейки и может выполняться шаг за шагом. Нажмите на маленькую кнопку Воспроизведения рядом с ячейкой или выберите ячейку и нажмите Shift Enter, чтобы выполнить ячейку. Начните с импорта всех необходимых пакетов для анализа.
Выполните следующую ячейку, чтобы запустить запрос файла. Выберите папку, содержащую один или несколько MP-видеофайлов для анализа, и нажмите Выбрать папку. Список выбранных файлов выводится под ячейкой.
Чтобы удалить доминирующее статическое рассеяние света с помощью алгоритма оценки фона по пикселям, выберите параметр непрерывной медианы для режима параметра и установите соответствующую длину для скользящего медианного окна. При необходимости сохраните фильмы после удаления фона, установив save_processed_movies True, чтобы использовать их для обнаружения частиц и связывания траекторий. Убедитесь, что установлены параллельные Значения True и GPU False для обработки на ЦП или наоборот для обработки на ГРАФИЧЕСКОМ процессоре.
Частицы и их соответствующее положение идентифицируются и локализуются на протяжении всего фильма. Настройте чувствительность обнаружения частиц с помощью порогового параметра, который используется для выделения потенциальных пятен путем бинаризации изображения. Изучите влияние изменяющихся пороговых параметров на чувствительность обнаружения пятен в отдельной записной книжке под названием Movie visualization.
ipy ноутбук. После загрузки фильма в кадр просмотрщик использует ползунок порога, чтобы настроить порог обнаружения частиц и найти соответствующую настройку. Вернитесь к другой записной книжке, выберите три параметра для связывания частиц в последовательных кадрах в траектории с помощью trackpy пакета Python.
Установите максимальное смещение частиц из одного кадра в другой в соответствии с максимальной ожидаемой скоростью диффузии. Выберите максимальное количество кадров, в которых частица может исчезнуть и появиться вновь, но все равно считаться той же частицей. Траектории со слишком малым количеством точек могут быть удалены с помощью параметра minimum_trajectory_length для более надежного определения коэффициентов диффузии.
Зафиксируйте все параметры в ячейке, выполнив ее. Выполните следующую ячейку, чтобы проанализировать все выбранные видео с выбранными параметрами. Индикаторы выполнения для каждого шага обработки будут отображаться под ячейкой.
Это может занять некоторое время, в зависимости от длины видео, настроек параметров и оборудования. На следующем этапе программное обеспечение определяет коэффициенты диффузии для траекторий, найденных в предыдущем разделе, на основе как распределения расстояния скачка, так и анализа среднего квадратического смещения. Начните с указания frame_rate и pixel_size фильма.
Исправьте их, выполнив ячейку, затем запустите следующую ячейку и выберите родительский каталог, содержащий все CSV-файлы, сгенерированные trackpy. Список найденных CSV-файлов выводится под ячейкой. В следующей ячейке выберите имя контейнера HDF5, в котором хранятся результаты, и выполните его.
Наконец, выполните ячейку C.4 для выполнения диффузионного анализа. В ячейку С.5 вводят контраст с массой калибровочной линии параметров, что означает наклон и смещение, определяемые с помощью образцов известной массы и выполняющие его для преобразования всех контрастов частиц в молекулярную массу. Оцените кажущуюся плотность частиц на мембране, выполнив ячейку C.6, которая возвращает среднее значение плотности в терминах обнаруженных частиц и представляет траектории в каждом кадре в виде дополнительных столбцов в кадре данных.
Чтобы сгенерировать окончательный график корреляции массы и коэффициента диффузии, выполните ячейку D.1, чтобы загрузить запрос файла и указать файл HDF5, содержащий результаты MSPT, затем выберите либо набор данных из одного видео для построения в ячейке D.2, либо объедините данные из нескольких видео в один кадр данных, выполнив ячейку D.3. В этом примере, поскольку все видео являются репликами идентичных образцов, набор данных объединяется в пул. Наконец, нанесите график плотности ядра 2D, выполнив ячейку D.4.
Если это достигнуто, укажите место для сохранения графика в PDF-файл в ячейке D.5 и выполните его. Здесь показаны репрезентативные изображения шероховатости поверхности стеклянной крышки во время формирования поддерживаемого липидного бислоя с неповрежденным поддерживаемым липидным бислоем и примерных белков, восстановленных на SLB. Все четыре примера отображаются в основном режиме, к которому можно получить доступ во время самого измерения, и в виде обработанных ратиометрических изображений после удаления фона на основе медианы.
Калибровка, которая переводит контраст в молекулярную массу, может быть достигнута путем присоединения биомолекул известной массы к SLB через комплекс биотин-стрептавидин-биотин. В качестве примерной стратегии можно использовать биотинилированные варианты бычьего сывороточного альбумина, белка А, щелочной фосфатазы и фибронектина, которые связываются со стрептавидином, который сам связан с биотинсодержащими липидами в мембране. Все более выраженный контраст этих образцовых макромолекул отражает увеличение молекулярной массы соответствующих биотинилированных стандартов.
Путем присвоения каждого пика контрастных гистограмм соответствующей массе олигомерного состояния стандартного белка выявляется линейная зависимость между контрастом и массой, которая впоследствии может быть использована для анализа неизвестных макромолекулярных систем. Здесь показаны оценки плотности ядра 2D как массы, так и коэффициента диффузии четырехвалентного стрептавидина в комплексе с биотинилированной альдолазой или с биотин-модифицированным козьим анти-Rabbit антителом IgG. Репрезентативные изображения показывают сравнение определенных масс олигомеров для комплекса четырехвалентного стрептавидина с биотин-модифицированной альдолазой или IgG и ожидаемыми молекулярными массами.
С помощью MSPT мы можем отслеживать биомолекулы непосредственно на липидных мембранах, определять, какую массу они имеют, как они движутся и как они взаимодействуют. Я уверен, что эта техника изменит наше понимание биологических процессов на мембранах и с ними.
