В прошлом характеристика иммунотерапии в модели морских свинок ограничивалась измерением гуморального иммунитета. Анализ ELISpot преодолевает это ограничение, и это поможет исследователям генерировать более значимые данные в этой модели животных. Основным преимуществом этой техники является то, что клетки получены из периферической крови.
Некропсия не требуется. Это позволяет измерять не только величину, но и кинетику Т-клеточных реакций у отдельных морских свинок во время естественной инфекции или на протяжении всего режима вакцинации. Демонстрацией процедуры будет Холли Пью.
Она научный сотрудник доклинического отдела R и D Inovio. Для начала добавьте 15 микролитров 35% этанола к каждой пластине анализа ELISpot. Через 60 секунд добавьте 150 микролитров PBS к каждой колодец.
И инвертировать пластины, чтобы остановить этанол предварительной обработки. Большой уход также следует проявлять при обработке пластин анализа ELISpot, чтобы избежать загрязнения или повреждения мембраны. Для мытья пластины добавить 250 микролитров PBS к каждому хорошо.
После повторения мытья еще два раза, добавить 100 микролитров захвата анти-морской свинки интерферона гамма-антитела VE4 к каждому хорошо. Затем инкубировать пластину, по крайней мере 12 часов при 4 градусах по Цельсию. После инкубационого периода мыть тарелки три раза.
Добавьте 200 микролитров блокирующего буфера к каждой колодец. Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение двух часов. Затем мыть тарелки еще три раза.
Подготовка конических трубок с 4,5 мл градиентной среды плотности комнатной температуры. Затем смешайте равный объем раствора соли Hanks'Balanced с кровью. Слой разбавленной крови постепенно над плотностью градиента среды, заботясь, чтобы не нарушить интерфейс.
После этого центрифуга труб при температуре 800 х г в течение 30 минут без тормозов при комнатной температуре. Снимите трубку с центрифуги, заботясь о том, чтобы не беспокоить слои. После правильной идентификации слоев аспирировать полный слой баффи пальто для сбора ПХМ.
Медленно слой HBSS разбавленной крови на плотность градиента среды. Избегайте каких-либо нарушений трубки и выключите центрифугу тормоза. Перенесите клетки в новую трубку по 15 мл.
Затем разбавить клетки в R10 среды до общего объема 15 мл. После гранулирования клеток, отбросить супернатант и повторного высасывания клеток в 15 мл R10 среды. Перейдите подвеску клетки через 70-метровый клеточный ситечко в новую трубку.
Подсчитайте клетки и определите количество живых клеток с помощью теста trypan blue exclusion Test. Затем разбавьте клетки со средой R10. Сначала снимите блокирующий буфер и вымойте пластины.
Для каждого образца PBMC указывают трипликаты положительного контроля, отрицательного контроля и каждого стимулятора, специфичного для эксперимента. Разбавить белковый пептидный бассейн в R10 среды до трех раз желаемой конечной концентрации. После этого добавьте 50 микролитров пептидной средней смеси R10 в стимулирующие испытательные скважины пластины.
Затем добавьте 50 микролитров пептидной формулировки МТ в R10 medium к отрицательным контрольным скважинам пластины. Добавьте ConA в R10 средних к положительному контролю скважин пластины, а затем добавить 100 микролитров подвески PBMC для всех скважин. Поместите пластину ELISpot на овеную поверхность в инкубаторе и не нарушайте пластину в инкубационный период.
После тщательного удаления пластины из инкубатора, инвертировать пластину, чтобы удалить супернатант. Затем мыть тарелку три раза. Добавьте 100 микролитров разбавленного биотинилированного обнаружения захвата анти-морской свинки интерферона гамма-антитела N-G3 к каждой хорошо.
Затем инкубировать пластину при комнатной температуре в течение двух часов. Инвертировать пластину, чтобы удалить раствор антитела и повторить мыть три раза. После удаления PBS из пластины, добавить 100 микролитров ALP конъюгированных стрептавидин разбавленных в блокирующий буфер для каждой хорошо.
Затем инкубировать тарелку при комнатной температуре в течение одного часа. Инвертировать пластину, чтобы отказаться от раствора АЛП стрептавидина и мыть пластину дважды. Инвертировать пластину и пятно его против чистого бумажного полотенца, чтобы удалить излишки PBS.
После этого мыть пластины с 250 микролитров Ultrapure DI воды на колодец. Инвертировать тарелку и удалить избыток воды с чистым бумажным полотенцем. Далее добавьте 100 микролитров субстратного раствора BCIP/NBT к каждой колодец.
Инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 20 минут, защищенных от света. Промыть тарелку четыре раза с DI воды. Затем инвертировать и нажмите пластину, чтобы удалить избыток воды.
Наконец, удалите пластиковый дренаж со дна пластины и дайте мембране полностью высохнуть. После успешной градиентной центрифугации плотности, как было попродемонстрировано ранее, красная вязкая жидкость в нижней части трубки должна содержать большую часть красных кровяных телец. Слой буйного слоя находится между слоем плазмы и градиентной средой плотности.
Предварительная обработка скважин до добавления улавливания антитела, анализ отображается улучшение определения наряду с сокращением числа неспецифических пятен в отрицательном контроля скважин. Пятна указывают на интерферон гамма производства Т-клеток в популяции PBMC. При попытке этого метода, важно помнить, чтобы тщательно, но быстро обрабатывать кровь.
Это улучшит жизнеспособность клеток, улучшит образование пятен и уменьшит образование неспецифических пятен. Не забывайте, что работа с кровью и BCIP / NBT субстрат может быть опасным и меры предосторожности, такие как ношение соответствующих СИЗ всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры. Я считаю, что этот протокол позволяет исследователям изучать болезни с важным Т-клеточным компонентом, таким как туберкулез, Эбола и ВПГ.
Важно отметить, что он будет усовершенствовать разработку протоколов вакцинации в модели морских свинок и сократит использование менее актуальных моделей животных.
