Лимфомы являются гисто логически сложными опухолями. Таким образом, мультиплексный флуоресцентный иммуногистохимия предлагает преимущества по сравнению с обычной хромогенной иммуногистохимией для изучения маркеров интереса к опухолевым клеткам и микроокноронии. Этот метод имеет потенциал для стандартизации скоринга антител на основе окрашивания в гистологических образцов лимфомы, процесс, который исторически был сложным из-за сложности микроокноронирования опухоли.
В частности, мультиплексированная флуоресцентная иммуногистохимия и спектральная визуализация позволяют количественно измерять множественные пятна в пределах одного слайда, тем самым позволяя оценить совместное выражение антигена и спациальные отношения внутри клинического материала. Начните с погружения де-восковых и регидратированных слайдов в стандартный буфер поиска антигена в микроволновой печи сохранить стеклянную банку и выполнения тепловых эпитоп поиска в подходящей микроволновой печи. Выполните дополнительные раунды зачистки микроволновой печи в зависимости от положения антитела в окончательной последовательности мультиплекса.
Например, четвертое антитело требует трех дополнительных раундов микроволновой зачистки до окрашивания. После завершения процесса зачистки, используйте типсы и теплостойкие перчатки для передачи слайдов в дистиллированной воде при комнатной температуре, по крайней мере 10 минут остыть. Когда раствор поиска антигена остынет, блокируйте активность пероксидазы тканей коммерческим блоком пероксидаса в течение 10 минут, а затем пятиминутной стиркой в трис-буферном солевом растворе, или TBS, и неионной моющее средство.
Блокируйте любое неспецифическое окрашивание 10-минутной инкубацией в блокирующий буфер с последующим инкубацией с первичным антителом интереса при комнатной температуре в течение 30 минут и три пятиминутные промывания буфером TBS-D. Затем инкубировать образцы с соответствующим пероксидасом хрена спрягается вторичное антитело в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем три моет в буфер TBS-D, как попродемонстрировано. После последней стирки нанесите на слайды соответствующий тирамид на основе флуоресцентного реагента в течение пяти минут инкубации при комнатной температуре с последующим тремя пятиминутными промывки TBS-D.
Выполните дополнительную зачистку на основе микроволновой печи, чтобы удалить первичные и вторичные антитела в свежем растворе поиска антигена, как попродемонстрировано. В конце поиска, охладить слайды в дистиллированной воде и высушить области на слайдах без ткани с лабораторными салфетками. Инкубировать слайд с dappy в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем три TBS-D моет.
Затем тщательно высушите слайды лабораторными салфетками, не контактируете с тканями и смонтировать образцы с соответствующей монтажной средой для визуализации. Для моноплексного сканирования слайдов выберите соответствующие фильтры из флюорофоров, используемых для маркировки образцов, и изучите каждый маркер и соответствующий канал флуоресценции, чтобы определить подходящее время экспозиции для получения чистого сигнала, сосредоточив внимание на компоненте ткани, который должен иметь самый сильный сигнал для маркера. Чтобы продать перекрестную сравнение интенсивности пикселей, используйте настройку живой камеры, чтобы отрегулировать время экспозиции в каждом отдельном канале до тех пор, пока в изображении живой камеры не будет переэкспонированных областей.
Когда все слайды были отсканированы, приобрести смоделированные яркие изображения поля, чтобы визуально сравнить с нормальным иммуноистохимическим рисунком и определить, правильно ли окрашивание. Для сканирования микроаррейных слайдов тканей используйте режим сканирования микроаррей тканей в системе визуализации и соответствующий алгоритм автофокусировки. Для слайдов раздела целых тканей, есть слайды рассмотрены квалифицированным патологоанатомом, чтобы выбрать оптимальные изображения из наиболее репрезентативных областей опухоли.
Перед началом анализа выберите маркер опухоли для выявления клеток, представляющих интерес для анализа. У патологоанатома обзор изображений и решить, является ли сегментация тканей не требуется. При необходимости выберите соответствующие регионы управления для сегментации и проверьте, может ли программное обеспечение для анализа изображений правильно идентифицировать такие регионы.
После сегментации клеток, иметь патологоанатом обзор карты сегментации для обеспечения верности предполагаемого подхода сегментации и обзор отдельных изображений, чтобы определить, является ли сегментация клеток является адекватной или если дополнительные сегментации тканей требуется для выбора регионов, обогащенных для опухолевых клеток, стромы и или некроза. Затем определите оптическое значение интенсивности положительного отсечения для каждого маркера в сочетании с патологоанатомом и создать гистограммы в соответствующей программе программного обеспечения статистики для анализа частотного распределения интенсивности маркера на клетку. Для генерации процентных данных для конкретных маркеров, представляющих интерес в определенных ячейках, вставьте таблицу разворота в таблицу данных и выберите Sum для расчета положительного процента одного маркера интереса.
Будет рассчитано общее количество маркерных положительных ячеек, разделенных на общее число. Результатом является маркер положительный процент клеток с одним ядром, или один номер исследования. Для генерации числовых данных, получить среднюю интенсивность каждого маркера интереса во всех клетках исследования в выборке для извлечения медианного нормализованного числа для каждого маркера каждого ядра или исследования числа.
Здесь показаны репрезентативные мультиплексные флуоресцентные иммуногистохимические изображения для диффузного большого образца В-клеточной лимфомы с перестановкой генов c-MYC и BCL2. Смоделированные яркие иммуногистохимические изображения поля демонстрируют аналогичную модель окрашивания маркера опухоли. Применение мультиплексных флуоресцентных иммуногистохимических изображений к Т-клеточной панели при ангиоиммунобласти Т-клеточных лимфом выявляет неоднородность клеточного образца опухоли.
Здесь показана оптимизация образца контроля миндалин и полученный анализ данных. Различные программы анализа изображений могут быть использованы после несмешного шага для количественного выражения маркера и локализации опухолевых клеток и микрооквидения опухоли. Этот метод прокладывает путь для исследователей, чтобы изучить совместное выражение нескольких маркеров в конкретных типах клеток в отдельных тканях разделов лимфомы.
Позаботьтесь, чтобы предотвратить тепловые травмы во время микроволновых шагов и быть в курсе рисков падения во время сканирования шаги, которые выполняются в палубе.
