Linfomas são tumores histologicamente complexos. Portanto, a imunohistoquímica fluorescente multiplexada oferece vantagens sobre a imunohistoquímica cromogênica convencional para estudar marcadores de interesse nas células tumorais e no microambiente. Essa técnica tem o potencial de padronizar a pontuação de manchas à base de anticorpos em amostras de linfoma histológico, processo historicamente desafiador devido à complexidade do microambiente tumoral.
Especificamente, a imunohistoquímica fluorescente multiplexada e a imagem espectral permitem a medição quantitativa de múltiplas manchas dentro de um único slide, permitindo assim a avaliação da co expressão do antígeno e da relação espacial dentro do material clínico. Comece imergindo os slides depilados e rehidratados em um tampão de recuperação de antígeno padrão em um frasco de vidro de micro-ondas e realizando recuperação de epítope induzida pelo calor em um micro-ondas adequado. Realize rodadas adicionais de descascamento de micro-ondas com base na posição do anticorpo na sequência multiplex final.
Por exemplo, o quarto anticorpo requer três rodadas adicionais de descascamento de micro-ondas antes da coloração. Após a conclusão do processo de descascamento, use fórceps e luvas à prova de calor para transferir os slides para água destilada em temperatura ambiente por pelo menos 10 minutos. Quando a solução de recuperação de antígeno tiver esfriado, bloqueie a atividade de peroxidase tecidual com um bloco comercial de peroxidase por 10 minutos seguido de uma lavagem de cinco minutos em soro fisiológico tris-tampão, ou TBS, e um detergente não iônico.
Bloqueie qualquer coloração inespecífica com uma incubação de 10 minutos no buffer de bloqueio seguido de incubação com o anticorpo primário de interesse à temperatura ambiente por 30 minutos e três lavagens de cinco minutos com tampão TBS-D. Em seguida, incubar as amostras com um anticorpo secundário conjugado de rabanete apropriado por 15 minutos à temperatura ambiente, seguido por três lavagens em tampão TBS-D, como demonstrado. Após a última lavagem, aplique um reagente fluorescente à base de tirado apropriado nos slides para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, seguido por três lavagens TBS-D de cinco minutos.
Realize uma desmontagem adicional baseada em micro-ondas para remover os anticorpos primários e secundários em uma solução de recuperação de antígeno fresco, conforme demonstrado. No final da recuperação, esfrie os slides em água destilada e seque as áreas nas lâminas sem tecido com lenços de laboratório. Incubar slide com dappy por 10 minutos à temperatura ambiente seguido de três lavagens TBS-D.
Em seguida, seque cuidadosamente as lâminas com lenços de laboratório sem entrar em contato com os tecidos e monte as amostras com um meio de montagem apropriado para a imagem. Para a varredura de slides monoplex, selecione os filtros apropriados dos fluoroforos utilizados para rotular as amostras e examinar cada marcador e seu canal de fluorescência correspondente para identificar um tempo adequado de exposição para a obtenção de um sinal limpo, focando no componente tecidual que deve ter o sinal mais forte para o marcador. Para permitir a comparação entre amostras da intensidade do pixel, use a configuração da câmera ao vivo para ajustar o tempo de exposição em cada canal individual até que não haja áreas superexpostas na imagem da câmera ao vivo.
Quando todos os slides tiverem sido escaneados, adquira imagens simuladas de campo brilhante para comparar visualmente com o padrão imunohistoquímico normal e determinar se o padrão de coloração está correto. Para digitalizar slides de microarray tecidual, use o modo de varredura de microarray tecidual no sistema de imagem e um algoritmo de foco automático apropriado. Para lâminas de seção de tecido inteiro, tenha os slides revisados por um patologista qualificado para selecionar imagens ideais das áreas tumorais mais representativas.
Antes de iniciar a análise, selecione um marcador tumoral para identificar as células de interesse para a análise. Consulte o patologista para revisar as imagens e decidir se a segmentação tecidual é necessária. Se necessário, selecione as regiões de controle apropriadas para segmentação e verifique se o software de análise de imagens pode identificar corretamente tais regiões.
Após a segmentação celular, o patologista revise o mapa de segmentação para garantir a fidelidade da abordagem de segmentação pretendida e revise imagens individuais para determinar se a segmentação celular é adequada ou se a segmentação adicional de tecidos é necessária para selecionar regiões enriquecidas para células tumorais, estroma e ou necrose. Em seguida, determine o valor de corte positivo de intensidade óptica para cada marcador em conjunto com o patologista e gere histogramas em um programa de software estatístico apropriado para analisar a distribuição de frequência da intensidade do marcador por célula. Para gerar dados percentuais para marcadores específicos de interesse dentro de células definidas, insira uma tabela pivô na folha de dados e selecione Sum para calcular a porcentagem de positividade de um único marcador de interesse.
O número total de células positivas de marcadores divididas pelo número total será calculado. O resultado é a porcentagem de células positivas marcadores com um núcleo, ou um número de estudo. Para gerar dados numéricos, obtenha a intensidade média de cada marcador de interesse em todas as células estudadas dentro de uma amostra para extrair a contagem mediana normalizada para cada marcador de cada núcleo ou número de estudo.
Aqui, são mostradas imagens imunohistoquímicas fluorescentes multiplex representativas para uma amostra difusa de linfoma de células B com rearranjo genético c-MYC e BCL2. Imagens imunohistoquímicas de campo brilhante simuladas demonstram um padrão de coloração de marcador tumoral semelhante. A aplicação de imagens imunohistoquímicas fluorescentes multiplex a um painel de células T em linfomas angioimunoblásticos de células T revela a heterogeneidade celular da amostra do tumor.
Aqui, mostra-se a otimização de uma amostra de controle de amígdalas e a análise de dados resultante. Uma variedade de programas de software de análise de imagem pode ser usada após o passo descompra para quantificar a expressão e localização do marcador em células tumorais e no microambiente tumoral. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores estudarem a coexpressão de múltiplos marcadores dentro de tipos de células específicas em seções de linfoma de tecidos únicos.
Tome cuidado para evitar lesões induzidas pelo calor durante as etapas de micro-ondas e esteja ciente dos riscos de queda durante as etapas de varredura que são realizadas no deck.
