Los linfomas son tumores histológicamente complejos. Por lo tanto, la inmunohistoquímica fluorescente multiplexada ofrece ventajas sobre la inmunohistoquímica cromogénica convencional para estudiar marcadores de interés en las células tumorales y el microambiente. Esta técnica tiene el potencial de estandarizar la puntuación de la tinción basada en anticuerpos en muestras de linfoma histológico, un proceso que históricamente ha sido difícil debido a la complejidad del microambiente tumoral.
Específicamente, la inmunohistoquímica fluorescente multiplexada y las imágenes espectrales permiten la medición cuantitativa de múltiples manchas dentro de una sola diapositiva, permitiendo así la evaluación de la coexpresión del antígeno y la relación espacial dentro del material clínico. Comience sumergiendo los portaobjetos descerados y rehidratados en un tampón de recuperación de antígenos estándar en un frasco de vidrio guardado en microondas y realizando la recuperación de epítopos inducidos por el calor en un microondas adecuado. Realice rondas adicionales de desmontaje por microondas en función de la posición del anticuerpo en la secuencia multiplexada final.
Por ejemplo, el cuarto anticuerpo requiere tres rondas adicionales de desmontaje de microondas antes de la tinción. Después de completar el proceso de desmontaje, utilice fórceps y guantes a prueba de calor para transferir los portaobjetos al agua destilada a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos de enfriamiento. Cuando la solución de recuperación de antígenos se haya enfriado, bloquee la actividad de la peroxidasa del tejido con un bloque comercial de peroxidasa durante 10 minutos seguido de un lavado de cinco minutos en solución salina tampón tris, o TBS, y un detergente no iónico.
Bloquear cualquier tinción inespecífico con una incubación de 10 minutos en tampón de bloqueo seguida de incubación con el anticuerpo primario de interés a temperatura ambiente durante 30 minutos y tres lavados de cinco minutos con tampón TBS-D. A continuación, incubar las muestras con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante apropiado durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de tres lavados en tampón TBS-D como se ha demostrado. Después del último lavado, aplique un reactivo fluorescente adecuado a base de tiromida en los portaobjetos para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente seguida de tres lavados TBS-D de cinco minutos.
Realice un desmontaje adicional a base de microondas para eliminar los anticuerpos primarios y secundarios en la solución de recuperación de antígenos frescos, como se ha demostrado. Al final de la recuperación, enfríe los portaobjetos en agua destilada y seque las áreas de los toboganes sin tejido con toallitas de laboratorio. Incubar el tobogán con dappy durante 10 minutos a temperatura ambiente seguido de tres lavados TBS-D.
A continuación, seque cuidadosamente las diapositivas con toallitas de laboratorio sin ponerse en contacto con los tejidos y monte las muestras con un medio de montaje adecuado para la toma de imágenes. Para el escaneo de diapositivas monoplex, seleccione los filtros apropiados de los fluoróforos utilizados para etiquetar las muestras y examine cada marcador y su canal de fluorescencia correspondiente para identificar un tiempo de exposición adecuado para obtener una señal limpia, centrándose en el componente de tejido que debe tener la señal más fuerte para el marcador. Para permitir la comparación entre muestras de la intensidad de píxeles, utilice la configuración de la cámara en directo para ajustar el tiempo de exposición en cada canal individual hasta que no haya áreas sobreexpuestas en la imagen de la cámara en vivo.
Cuando se hayan escaneado todas las diapositivas, adquiera imágenes de campo brillante simuladas para comparar visualmente con el patrón inmunohistoquímico normal y para determinar si el patrón de tinción es correcto. Para escanear diapositivas de microarray de tejido, utilice el modo de exploración de microarray de tejido en el sistema de imágenes y un algoritmo de enfoque automático adecuado. Para las diapositivas de sección de tejido entero, haga que las diapositivas sean revisadas por un patólogo calificado para seleccionar imágenes óptimas de las áreas tumorales más representativas.
Antes de comenzar el análisis, seleccione un marcador tumoral para identificar las células de interés para el análisis. Pida a un patólogo que revise las imágenes y decida si se requiere segmentación de tejidos. Si es necesario, seleccione las regiones de control adecuadas para la segmentación y compruebe si el software de análisis de imágenes puede identificar correctamente dichas regiones.
Después de la segmentación celular, pida al patólogo que revise el mapa de segmentación para garantizar la fidelidad del enfoque de segmentación previsto y revise imágenes individuales para determinar si la segmentación celular es adecuada o si se requiere una segmentación de tejido adicional para seleccionar regiones enriquecidas para células tumorales, estroma y o necrosis. A continuación, determine el valor de corte positivo de intensidad óptica para cada marcador junto con el patólogo y genere histogramas en un programa de software estadístico adecuado para analizar la distribución de frecuencia de la intensidad del marcador por celda. Para generar datos de porcentaje para marcadores específicos de interés dentro de celdas definidas, inserte una tabla dinámica en la hoja de datos y seleccione Suma para calcular el porcentaje de positividad de un único marcador de interés.
Se calculará el número total de celdas positivas del marcador divididas por el número total. El resultado es el porcentaje de celda positiva del marcador con un núcleo o un número de estudio. Para generar datos numéricos, obtenga la intensidad media de cada marcador de interés en todas las células estudiadas dentro de una muestra para extraer el recuento normalizado medio para cada marcador de cada núcleo o número de estudio.
Aquí, se muestran imágenes inmunohistoquímicas fluorescentes multiplexas representativas para una muestra difusa de linfoma de células B grandes con reordenamiento del gen C-MYC y BCL2. Las imágenes inmunohistoquímicas de campo brillante simuladas muestran un patrón similar de tinción de marcadores tumorales. La aplicación de imágenes inmunohistoquímicas fluorescentes multiplex a un panel de células T en linfomas de células T angioinmunoblásticos revela la heterogeneidad celular de la muestra tumoral.
Aquí se muestra la optimización de una muestra de control de amígdalas y el análisis de datos resultante. Una variedad de programas de software de análisis de imágenes se pueden utilizar después del paso de desmezclado para cuantificar la expresión del marcador y la localización en las células tumorales y el microambiente tumoral. Esta técnica allana el camino para que los investigadores estudien la coexpresión de múltiples marcadores dentro de tipos celulares específicos en secciones de tejidos individuales del linfoma.
Tenga cuidado de prevenir lesiones inducidas por calor durante las medidas de microwaving y ser consciente de los riesgos de caída durante los pasos de escaneo que se realizan en la cubierta.
