Lenfomalar histolojik olarak karmaşık tümörlerdir. Bu nedenle, çok katlı floresan immünohistokimya tümör hücreleri ve mikroortamda ilgi belirteçleri çalışma için konvansiyonel kromojenik immünohistokimya üzerinde avantajlar sunuyor. Bu teknik histolojik lenfoma örneklerinde antikor bazlı boyama puanlama standartlaştırma potansiyeline sahiptir, tarihsel tümör mikroortamının karmaşıklığı nedeniyle zorlu bir süreçtir.
Özellikle, çok katlı floresan immünohistokimya ve spektral görüntüleme tek bir slayt içinde birden fazla leke kantitatif ölçüm sağlar, böylece klinik malzeme içinde antijen co ekspresyon ve aralıklı ilişkinin değerlendirilmesi sağlar. Bir mikrodalga kaydetmek cam kavanoz standart bir antijen alma tampon de-mumlu ve rehydrated slaytlar daldırma ve uygun bir mikrodalga ısı kaynaklı epitop alma gerçekleştirerek başlayın. Son multipleks dizisinde antikor konumuna göre mikrodalga sıyırma ek tur gerçekleştirin.
Örneğin, dördüncü antikor boyama önce mikrodalga sıyırma üç ek tur gerektirir. Sıyırma işlemi tamamlandıktan sonra, en az 10 dakika soğuması için oda sıcaklığında distile suya slaytlar aktarmak için forseps ve ısıya dayanıklı eldiven kullanın. Antijen alma solüsyonu soğuduğunda, ticari bir peroksidaz bloğu ile doku peroksidaz aktivitesini 10 dakika boyunca bloke edin ve ardından tris-tamponlu salin veya TBS'de beş dakikalık bir yıkama ve iyonik olmayan bir deterjan.
Tamponu bloke eden 10 dakikalık bir kuluçka ile spesifik olmayan lekeleri engelleyin ve ardından oda sıcaklığında ana ilgi antikorunu 30 dakika ve TBS-D tamponu ile üç beş dakikalık yıkar. Daha sonra, uygun bir horseradish peroksidaz ile kuluçka oda sıcaklığında 15 dakika ikincil antikor konjuge, gösterildiği gibi TBS-D tampon üç yıkar izledi. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında beş dakikalık kuluçka için slaytlara uygun bir tiramid bazlı floresan reaktif uygulayın ve ardından üç beş dakikalık TBS-D yıkayın.
Gösterildiği gibi taze antijen alma çözeltisi birincil ve ikincil antikorları kaldırmak için ek bir mikrodalga tabanlı sıyırma gerçekleştirin. Geri alma sonunda, distile suda slaytlar serin ve laboratuvar mendilleri ile doku olmadan slaytlar üzerinde alanları kuru. Oda sıcaklığında 10 dakika dappy ile inküböz slayt üç TBS-D yıkayArak takip.
Daha sonra, dokulara temas etmeden laboratuar mendilleri ile slaytları dikkatlice kurulayın ve numuneleri görüntüleme için uygun bir montaj ortamıyla monte edin. Monopleks slayt taraması için, numuneleri etiketlemek için kullanılan floroforlardan uygun filtreleri seçin ve işaretçi için en güçlü sinyale sahip olması gereken doku bileşenine odaklanarak temiz bir sinyal elde etmek için uygun bir pozlama süresini belirlemek için her belirteç ve buna karşılık gelen floresan kanalını inceleyin. Piksel yoğunluğunun çapraz örnekkarşılaştırmasına izin vermek için, canlı kamera görüntüsünde aşırı pozlanmış alanlar kalmadan her bir kanaldaki pozlama süresini ayarlamak için canlı kamera ayarını kullanın.
Tüm slaytlar tarandığında, normal immünohistokimyasal desenle görsel olarak karşılaştırmak ve boyama deseninin doğru olup olmadığını belirlemek için simüle edilmiş parlak alan görüntüleri edinin. Doku mikrodizi slaytlarını taramak için görüntüleme sistemindeki doku mikrodizi tarama modunu ve uygun bir otomatik odaklama algoritmasını kullanın. Tüm doku kesiti slaytları için, slaytlar en temsili tümör bölgelerinden optimal görüntüleri seçmek için nitelikli bir patolog tarafından gözden geçirilir.
Analize başlamadan önce, analiz için ilgi hücreleri tanımlamak için bir tümör belirteci seçin. Bir patolog görüntüleri gözden ve doku segmentasyonu gerekli olup olmadığına karar verin. Gerekirse, segmentasyon için uygun denetim bölgelerini seçin ve görüntü çözümleme yazılımının bu bölgeleri doğru şekilde tanımlayıp tanımlayamadığını kontrol edin.
Hücre segmentasyonundan sonra, patoloğun amaçlanan segmentasyon yaklaşımının doğrulmasını sağlamak için segmentasyon haritasını gözden geçirmesini ve hücre segmentasyonunun yeterli olup olmadığını veya tümör hücreleri, stroma veya nekroz için zenginleştirilmiş bölgeleri seçmek için ek doku segmentasyonu gerekip gerekmediğini belirlemek için tek tek görüntüleri gözden geçirmesini sağlayın. Daha sonra patolog ile birlikte her belirteç için optik yoğunluk pozitif kesme değerini belirlemek ve hücre başına marker yoğunluğu frekans dağılımıanaliz etmek için uygun bir istatistik yazılım programında histogramlar oluşturmak. Tanımlı hücreler içinde belirli ilgi işaretleri için yüzde verileri oluşturmak için, veri sayfasına bir özet tablo ekleyin ve tek bir ilgi işaretinin pozitiflik yüzdesini hesaplamak için Toplam'ı seçin.
Toplam sayıya bölünen işaretleyici pozitif hücrelerin toplam sayısı hesaplanır. Sonuç, bir çekirdek veya bir çalışma numarası ile marker pozitif hücre yüzdesidir. Sayısal veri oluşturmak için, her çekirdek veya çalışma numarasının her bir belirteci için ortanca normalleştirilmiş sayımı ayıklamak için bir örnek teki tüm hücre çalışmalarında ilginin ortalama yoğunluğunu elde edin.
Burada c-MYC ve BCL2 gen rearanyaygın büyük B hücreli lenfoma örneği için temsili multiks floresan immünhistokimyasal görüntüler gösterilmiştir. Simüle parlak alan immünohistokimyasal görüntüler benzer bir tümör belirteç boyama deseni göstermektedir. Anjiyoimmünoblastik T-hücreli lenfomalarda t-hücre paneline multiks floresan immünohistokimyasal görüntülerin uygulanması tümör örneğinin hücreheterojenliğini ortaya koymaktadır.
Burada bademcik kontrol numunesinin optimizasyonu ve elde edilen veri analizi gösterilmiştir. Tümör hücrelerinde ve tümör mikroortamında marker ekspresyonu ve lokalizasyonu niantitate için karıştırma aşamasından sonra çeşitli görüntü analizi yazılım programları kullanılabilir. Bu teknik, araştırmacıların lenfomanın tek doku bölümlerinde belirli hücre tipleri içinde birden fazla belirteçlerin ortak ekspresyonunu incelemelerinin önünü açıyor.
Mikro dalgalı adımlar sırasında ısıya bağlı yaralanmaları önlemeye özen ve güvertede gerçekleştirilen tarama adımları sırasında düşme risklerine dikkat edin.
