Мы рассмотрели настроения активации и пересчета лекарств S1PRS экипажем, эм-манипуляции и состояние ЖКТ A M P A и менее значимую основу для разработки препарата, который твердо нацелен на S1PRS Достижения в том, чтобы позволить вирулизировать магнистическое подкрашивание стимуляции GP ZR или жилья и дополнительные преимущества в выявлении нормальных сайтов связывания для создания таргетных препаратов T BCR. Качество образца является основой для всего в правильном ЭМ-эксперименте. Существенными факторами для простой подготовки являются различные состояния продукта продажи линии SF и концентрация N g Демонстрацией процедуры будет Хели Ванг, аспирант моего уровня.
Для нагрузки на очистку белка этот палец сцены одним фосфатным рецептором или S одним P R S G белкового комплексного раствора с исключением размера хроматографии или S E C гелевой фильтрационной колонки предварительно уравновешенной буфером S E C при скорости потока 0,5 миллилитра в минуту при четырех градусах Цельсия. Чтобы использовать собранные фракции для криоэлектронной микроскопии, концентрируйте их с помощью отсечного концентратора мощностью 100 килодалтон при 1 300 XG при четырех градусах Цельсия. Во время обработки данных для 2D-классификации при предварительной классификации частиц выберите функцию 2D-классификации в программном обеспечении Rely On и нажмите кнопку обзора справа от файла звезды входных изображений в опции IO.
Затем выберите particles.star. Далее в опции оптимизации задайте количество классов равным 100, а диаметр маски A — 140. В параметре вычисления установите число частиц в пуле равным 10 и введите каталог с быстрого и быстрого локального диска в поле копирования частицы в рабочий каталог.
Для более быстрой обработки выберите Да для используемого ускорения графического процессора. Для выбора подмножества хороших 2D-результатов в качестве шаблонов перейдите к опции ввода-вывода функции выбора подмножества и нажмите на кнопку обзора справа от выбранных классов из model.star. Затем выберите run_it025_model.
отметьте в качестве входных данных и нажмите на запуск во всплывающем окне, проверьте сортировку изображений и обратную сортировку. Затем нажмите на дисплей. После выбора хороших репрезентативных 2D-результатов в качестве ссылки на функцию автоматического выбора, щелкните правой кнопкой мыши и выберите сохранить выбранные классы.
Чтобы использовать шаблон для второго раунда автоподбора, перейдите к опции ввода-вывода функции автоподбора. Нажмите кнопку обзора справа от входных микроснимков для автоматического выбора и выберите micrographs.star. Затем нажмите на обзор справа от 2D-ссылок и выберите class_averages.star.
Кроме того, выберите no для или используйте leplossian в Gaussian. Затем выполните извлечение частиц с помощью суффикса подчеркивания шнура, подчеркивания auto pick.star. Выполните 2D-классификацию с использованием частиц.
star, с последующим выделением подмножества с помощью run подчеркивание его ноль 20 five_optimizer. star Для извлечения частиц после нажатия кнопки «Обзор» справа от файла звезды микрофотографии в параметре «Ввод-вывод» выберите «Микроснимки». и выберите да или повторно извлеките очищенные частицы.
После нажатия кнопки «Обзор» справа от файла звезды «Очищенные частицы» выберите «Частицы». star для генерации начальной 3D-модели и эталонной карты, нажмите на просмотр 3D начальной модели справа от входного файла звезды изображений в опции IO и выберите предыдущую particles.star. Затем в опции оптимизации установите количество классов равным одному, а диаметр маски A — 140.
Для 3D классификации и генерации предварительной 3D карты, после выбора частиц. как показано ранее, нажмите на обзор справа от справочной карты и выберите начальную точку подчеркивания модели mrc. Затем в параметре оптимизации установите число классов от четырех до шести, а диаметр маски A — 140.
Для генерации маски, выбрав хорошую 3D-карту в качестве входных данных в параметре ввода-вывода, установите начальный порог бинаризации равным 0,05, а двоичную карту расширить до этого количества пикселей до трех. Далее перейдите к параметру маски и установите. Добавьте мягкий край к этому количеству пикселей до восьми.
Для следующей обработки откройте программное обеспечение Trino Spark, создайте новую рабочую область и щелкните конструктор заданий для первого задания. Чтобы импортировать стек частиц, введите путь частицы в поле мета-пути частицы и путь к фильмам в поле пути данных частицы. Затем импортируйте 3D-тома, введя путь к лучшему 3D-тому, сгенерированному ранее, в путь к данным тома и выбрав маску для типа импортируемого тома.
Для неоднородной очистки перетащите ранее сгенерированные импортированные частицы подчеркивания в качестве входных частиц частиц неоднородных уточнений частиц. Импортированное подчеркивание громкости, подчеркивание единицы как ввод неоднородных уточнений объема объема и импортированная маска подчеркивания подчеркивает один как ввод неоднородной маски уточнений. Маска. Затем щелкните Q, чтобы начать обработку, и повторите процедуру, чтобы получить хорошее разрешение.
S1PRGI 3D карта. После построения плазмиды и подготовки к транзиторной трансфекции добавляют два микрограмма подготовленной ДНК в 200 микролитров трансфектного реагентного буфера. Перемешайте путем вихря в течение 10 секунд и ненадолго вращая смесь перед использованием.
Добавьте четыре микролитра трансфекционного реагента и перемешайте его путем вихря и вращения, как показано ранее. После инкубации трубки при комнатной температуре в течение 15 минут медленно опустите 200 микролитров трансфекционной смеси в каждую лунку из шести лунок пластины, содержащей CHOK one cells и осторожно встряхните пластину или тщательно перемешайте. После четырех-шести часов инкубации замените трансфекционную среду средой роста клеток, состоящей из среды F 12 и 10% fbs, прежде чем возвращать пластину в инкубатор.
Через 24-48 часов после трансекционного сбора клеток приостанавливают клетки в трех миллилитрах sa-буфера с D-люциферианской калиевой солью. Затем, используя многоканальную пипетку, добавьте 90 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку из 96 лунок, аккуратно перемешанную и инкубируем при комнатной температуре в течение 40 минут. Для определения флуоресцентного сигнала сначала готовят 10 растворов миллимолярного запаса сипонимода в D M S O. Затем производят последовательное разбавление в буфере H B S S, содержащем 25 микромолярного форскалина и стимулируют клетки 10 микролитрами различных концентраций этого раствора агониста в течение 30 минут.
Затем подсчитайте сигнал люминесценции в считывателе микропластин, выбрав люминесценцию для метода обнаружения. Конечная точка для типа считывания и люминесцентное волокно для типа оптики в соответствующем программном обеспечении. Кроме того, установите коэффициент усиления оптики на 255.
Затем импортируйте полученные значения флуоресцентного сигнала в программу электронных таблиц и обработайте данные с помощью функции нелинейной регрессионной кривой соответствия дозы. Комплекс S1PRS GI может быть успешно очищен с помощью хроматографии с исключением размера, которая была проверена страницей SDS. Более того, протокол электронной микроскопии, используемый в этом исследовании, был эффективен в дифференциации между частицами S1PRSGI с четкими и четко определенными 2D-классами и частицами низкого качества.
Кроме того, электронная микроскопическая карта S1PR3 GI с хорошим разрешением может быть сгенерирована корреляцией скорняжной оболочки путем неравномерной очистки. После структурного анализа функциональные анализы для S one P R three проводили путем трансфекции C H O K одной клетки с рецепторными и сенсорными плазмидами, что показало, что отношение плазмиды рецептора к плазмиде датчика от одного к трем дает оптимальные результаты. Однако результаты были менее реалистичными в чертовски 2 93 клетках В этой обработке выбор алгоритмов в секции частиц и секции 2D и 3D классификации важен для решения белковых комплексов MPS G, особенно для моделирования утечек и ЭКФ.
