Метод Contact Bubble Bilayer является альтернативным методом для обычных Lipid Bilayers. и этот метод позволяет более универсальную вибрацию через мембрану. Метод CBB интегрирует преимущества Planar Lipid Bilayer и метода зажима патчей.
По мере того как метод bilayer липидов CBB с произвольным составом липидов можно образовать. Мы разработали CBB для записи тока одного канала с высоким соотношением сигнала к шуму. Этот метод позволяет разновидности мембранных вибраций и предлагает обширную платформу типа к интерфейсу мембраны канала.
Каждый испытал дует мыльный пузырь. Аналогичные маневры принимаются для формирования CBB путем ручной тонкой настройки примененного давления, а не дует в рот. Практика и наслаждаться CBB.
К быть этой процедурой разгоняет фосфолипиды в хлороформе на пожеланную концентрацию в круглой колбе дна. Поместите раствор фосфолипида на вращающийся испаритель, подключенный к азотно-газового баллона. Поверните колбу под потоком азота при комнатной температуре до тех пор, пока не появится тонкая фосфолипидная пленка.
Затем поместите открытую колбу в децикатор, который подключен к вакуумной насосу. Использование вакуумного насоса аспирировать внутри децикатора в течение нескольких часов, чтобы удалить хлороформ тщательно. Впоследствии добавить соответствующий объем электролитного раствора в колбу и приостановить фосфолипид для получения двух миллигрм на миллилитр фосфолипидной суспензии.
Sonciate подвески в течение 20 до 30 секунд с помощью ванны sonicator для получения многослойной подвески пузырьков. Для приготовления протеолипосом, содержащих белки ионных каналов, добавьте белковый раствор в многослойную суспензию везикулы. И sonicate в течение нескольких секунд с помощью ванны sonicator.
Чтобы подготовить большие стеклянные пипетки, поместите стеклянный капилляр в пипетку шкив и изготовить микропипет с тонкой конические наконечник через два шага потянув. Затем установите микропипет на микро кузницу и свяжитесь с кончиком микропипета к платиновой нити на конические части диаметром от 30 до 50 микрометров. Нагрейте нить кратко и немедленно выключите ее.
Использование дистиллированной воды и этанола очистить поверхность стеклянной горки с мелкой хорошо. Затем нанесите силиконовый реагент на стеклянную горку и дайте реагенту полностью высохнуть в воздухе. Затем поместите стеклянную горку на сцену перевернутого микроскопа.
Добавьте 100 микролитров гексадекана в неглубокий колодец силиконовой стеклянной горки. С помощью трубчатого шприца заполните электролитный раствор до половины длины микропипета. Затем установите микропайпетт на держатель микропипюты с портом давления, что позволит электроду проволоки хлорида серебра/серебра замочить в растворе электролита пипетки.
Подключите один из держателей микропипеда к головной стадии усилителя зажима патча, а другой к электрической земле. Впоследствии подключите микроинъектор к порту давления держателя микропипюты. Отрегулируйте микропайпт в соответствующее положение над стадией перевернутого микроскопа с помощью микроманипулятора.
Чтобы отрегулировать потенциал смещения электрода, поместите один микролитер того же электролитного раствора, используемого для заполнения микропайпта на плоской поверхности вокруг мелкого колодец стеклянной горки для создания электролитного купола. Замочите кончик обоих микропипетов в электролитный купол. После этого отрегулируйте потенциал смещения электрода усилителя зажима патча.
Чтобы нарисовать липосомный раствор из кончика, добавьте один микролитер липосомного раствора на плоскую поверхность вокруг мелкого колодец слайд-стекла. Затем поместите кончик микропипета в липосому, содержащую купол. Аспирировать липосому, содержащую раствор с помощью микроинъектора.
Повторите процедуру для других mircopipette для аспирирующего канала восстановлены липосомы. Теперь поместите микропайп в гексадекан в мелководной колодец. Удар пузырь воды медленно, увеличивая давление, пока пузырь не достигнет желаемого размера и поддерживать такое же давление после этого.
Отбросьте пузырь, передавая кончик через масляный интерфейс воздуха, если трудно сохранить размер пузыря стабильным. Повторяйте процедуры до тех пор, пока не будут сформированы два стабильных пузыря. Установите контакт между двумя пузырьками.
Отладить давление, чтобы сохранить размер пузыря, потому что размер может постепенно меняться даже при постоянном внутри пузыря давления. Установите мембранный потенциал до нужного значения с помощью усилителя претензии патча и подождите появления тока канала. Для стабильного образования липидного билейера необходимо очистить пятна.
Стеклянные капилляры или пипетки препарат следует тщательно промыть и избежать загрязнения молекулами моющего средства. После того, как CBB сформировал молекулы канала либо в aqueous растворе или в липосоме были спонтанно вставлены в билейер в течение нескольких-десятков минут. Вставки каналов были подтверждены шагом мудрого увеличения текущей амплитуды под применяемый мембранный потенциал.
Двухслойный, образованный методом CBB, может быть разоблен на два монослоя. Ток канала pTB появился сразу после присоединения двух монослоев. И ток стал больше, как имеют контакт увеличил амплитуду тока был синхронизирован с отсоединения прикрепить манипуляции CBB.
Если количество выдува пузырьков увеличивает концентрацию липидов в аквозном растворе уменьшается и монослой не образуется. Затем попробуйте снять давление на липосомную секцию. После образования CBB и восстановления каналов вы можете попытаться варьировать составы аквозного раствора и мембраны с помощью изобилия или введения гидрофильных или гидрофобных веществ.
Метод CBB открыл универсальные способы изучения взаимодействия канала и мембраны.
