El método Contact Bubble Bilayer es una técnica alternativa para las bicapas lipídicas convencionales. y este método permite una vibración más versátil a través de la membrana. El método CBB integra los beneficios de Planar Lipid Bilayer y el método de abrazadera de parche.
Como técnica de bicapía de lípidos se puede formar un CBB con una composición lipídica arbitraria. Hemos desarrollado un CBB para grabaciones de corriente de canal único con alta relación señal-ruido. Este método permite variedades de vibraciones de membrana y ofrece una plataforma de tipo vasto a la interfaz de membrana de canal.
Todo el mundo ha experimentado soplando una burbuja de jabón. Maniobras similares se toman para la formación de CBB mediante el ajuste manual de la presión aplicada en lugar de soplar por la boca. Practica y disfruta del CBB.
Para ser este procedimiento dispersar los fosfolípidos en cloroformo a una concentración deseada en un matraz inferior redondo. Coloque la solución de fosfolípidos en un evaporador rotatorio conectado a un cilindro de gas nitrógeno. Gire el matraz bajo flujo de nitrógeno a temperatura ambiente hasta que aparezca una película fosfolípida delgada.
A continuación, coloque el matraz abierto en un desecador que esté conectado a una bomba de vacío. Usando la bomba de vacío aspirar el interior del desecador durante varias horas para eliminar el cloroformo a fondo. Posteriormente añadir un volumen adecuado de solución de electrolitos al matraz y suspender el fosfolípido para obtener una suspensión de fosfolípidos de dos mililitros por mililitro.
Sonciate la suspensión durante 20 a 30 segundos usando un sonicador de baño para obtener una suspensión de vesícula multicapa. Para la preparación de proteoliposomas que contengan proteínas de canal iónico, agregue una solución proteica a la suspensión de vesícula multicapa. Y sonicar durante varios segundos usando el sonicador de baño.
Para preparar pipetas de vidrio de diámetro grande, coloque un capilar de vidrio en un tirador de pipeta y fabrique la micropipeta con una punta cónica fina a través de un tirón de dos pasos. A continuación, ajuste la micropipeta en una micro forja y entre en contacto la punta de la micropipeta con un filamento de platino en la porción cónica con un diámetro de 30 a 50 micrómetros. Caliente el filamento brevemente y apáelo inmediatamente.
Usando agua destilada y etanol limpie la superficie del tobogán de vidrio con un pozo poco profundo. A continuación, aplique el reactivo de silicona sobre el portaobjetos de vidrio y deje que el reactivo se seque completamente en el aire. A continuación, coloque el portaobjetos de vidrio en el escenario de un microscopio invertido.
Añadir 100 microlitros de hexadecano en el pozo poco profundo del portaobjetos de vidrio siliconizado. Con una jeringa de tuberculina, llene la solución de electrolitos hasta la mitad de la longitud de la micropipeta. A continuación, ajuste la micropipeta en el soporte de micropipeta con el puerto de presión, lo que permite que el electrodo de alambre de cloruro de plata/plata se empape en la solución de electrolito de pipeta.
Conecte uno de los soportes de micropipeta a la etapa principal de un amplificador de abrazadera de parche y el otro al suelo eléctrico. Posteriormente conecte un microinyector al puerto de presión del soporte de micropipeta. Ajuste la micropipeta a una posición adecuada por encima de la etapa de un microscopio invertido utilizando el micromanipulador.
Para ajustar el potencial de desplazamiento del electrodo, coloque un microlitro de la misma solución de electrolito utilizada para llenar la micropipeta en la superficie plana alrededor del pozo poco profundo de la diapositiva de vidrio para crear una cúpula de electrolito. Sumerja la punta de ambas micropipetas en la cúpula de electrolitos. A continuación, ajuste el potencial de desplazamiento del electrodo del amplificador de abrazadera de parche.
Para extraer la solución liposoma de la punta, agregue un microlitro de solución liposoma en la superficie plana alrededor del pozo poco profundo del vaso deslizante. A continuación, coloque la punta de la micropipeta en el liposoma que contiene la cúpula. Aspirar el liposoma que contiene la solución utilizando el microinyector.
Repita el procedimiento para el otro mircopipetto para aspirar liposomas reconstituidos por canal. Ahora coloque la micropipeta en el hexadecano en el pozo poco profundo. Soplar una burbuja de agua lentamente aumentando la presión hasta que la burbuja alcance el tamaño deseado y mantener la misma presión a partir de entonces.
Deseche la burbuja pasando la punta a través de la interfaz aceite-aire si es difícil mantener el tamaño de la burbuja estable. Repita los procedimientos hasta que se formen dos burbujas estables. Establezca un contacto entre las dos burbujas.
Ajuste la presión para mantener el tamaño de la burbuja, ya que el tamaño puede cambiar gradualmente incluso a la presión constante dentro de la burbuja. Establezca el potencial de membrana en el valor adecuado utilizando el amplificador de reclamación de parche y espere a que surja la corriente del canal. Para la formación estable de la bicacapa lipídica es esencial limpiar las manchas.
La preparación capilar o pipeta de vidrio debe lavarse a fondo y evitar la contaminación por las moléculas de detergente. Una vez que el CBB había formado las moléculas del canal ya sea en solución acuosa o en el liposoma se insertaron espontáneamente en la bicapas en el lapso de unos pocos a docenas de minutos. Las inserciones de los canales fueron confirmadas por el aumento escalonado de la amplitud de corriente bajo el potencial de membrana aplicado.
Una bicacapa formada por el método CBB se puede desintegrar en dos monocapas. La corriente del canal pTB surgió inmediatamente después de conectar las dos monocapas. Y la corriente se hizo más grande a medida que el contacto aumentaba la amplitud de la corriente se sincronizaba con la manipulación de la conexión de desprendimiento del CBB.
Si el número de explosiones de burbujas aumenta la concentración de lípidos en la solución acuosa disminuye y la monocapa no se forma. Luego trata de aliviar la presión sobre la sección de liposomas. Una vez establecida la formación de CBB y la reconstitución del canal, puede intentar variar las composiciones de la solución acuosa y la membrana a través de la profusión o la inyección de sustancias hidrófilas o hidrófobas.
El método CBB ha abierto formas versátiles de explorar las interfaces de membrana de canal.
