Общая цель этой процедуры заключается в предоставлении метода оценки эндогенной активности киназы LRRK2 в периферической крови человека. Это достигается путем мониторинга LRRK2-опосредованного фосфорилирования rab белков, используя Майкл J.Fox Фонд фосфо-специфических Rab моноклональных антител. Здесь мы фокусируемся на человеческих периферических нейтрофилах крови как образовававую однородную популяцию участка с высоким уровнем экспрессии как Rab2, так и Rab10.
Изоляция нейтрофила основана на отрицательном отборе, который в течение 40 минут после завершения действия позволяет изоляцию 99%чистых и жизнеспособных нейтрофилов, а также дает большое количество уровней белка. Соберите 10 миллилитров крови в трубку для сбора крови. Смешайте осторожно, инвертирование труб семь-восемь раз.
Перенесите 10 миллилитров крови в 50 миллилитровую коническую трубку. Добавьте в кровь 100 микролитров раствора EDTA 1, 0,1 молярного раствора EDTA PBS, аккуратно перемешайте. Добавьте 500 микролитров изоляционных коктейлей, 50 микролитров на миллилитр из комплекта изоляции нейтрофилов в весь образец крови.
Vortex магнитные бусы из нейтрофилов изоляции комплекта в течение 30 секунд перед использованием для того, чтобы повторно очень тонкой магнитных бусин. Добавьте 500 магнитных бусин микролитров в образец крови и аккуратно перемешайте трубку несколько раз. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.
Пополнить трубку до 50 миллилитров с EDTA фондовый раствор 2. Это одно миллимолярдное решение EDTA PBS. Смешайте очень мягко трубы вверх и вниз два-три раза.
Поместите трубку в магнит и снимите крышку, чтобы избежать последующего возбуждения трубки. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Тщательно пипетка обогащенной клеточной подвески, которая содержит нейтрофилов в новую 50 миллилитров конической трубки.
Не прикасайтесь к стороне трубки, которая находится в контакте с магнитом и избежать сбора и возмущения красных кровяных телец в нижней части трубки. Оставьте около 10 миллилитров подвески красных кровяных телец позади в нижней части трубки. Вихрь магнитных бусин в течение 30 секунд перед использованием и добавить 0,5 миллилитров магнитных бусин в трубку, содержащую обогащенные нейтрофилов.
Смешайте осторожно, инвертирование трубки. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Поместите трубку в магнит и снимите крышку, чтобы избежать последующего возбуждения.
Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре. Тщательно пипетка обогащенной клеточной подвески, которая содержит нейтрофилов в новой 50 миллилитров конической трубки. Не прикасайтесь к стороне трубки, которая находится в контакте с магнитом.
Оставьте около пяти миллилитров подвески на дне трубки. Для обеспечения полного удаления магнитных бусин из клеточной смеси поместите в магнит трубку, содержащую обогащенные клетки. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
Тщательно пипетка обогащенной клеточной подвески, которая теперь содержит чистые нейтрофилов в новую 50 миллилитров конической трубки. Не прикасайтесь к стороне трубки, которая находится в контакте с магнитом. Оставьте около пяти миллилитров подвески в нижней части трубки.
Пополнить изолированные клетки с одним миллимолярной EDTA фондовый раствор 2 до конечного объема около 41 миллилитров. Pipette вверх и вниз, чтобы смешать. Разделите раствор поровну на две трубки с примерно 20 миллилитров в каждой трубке.
Центрифуга обе трубки при 335G в течение пяти минут. Во время шага центрифугации возьмите запас ингибитора MLi-2, 200 микромоляров слэш 1000X концентрации из минус 80 градусов морозильник и оставить при комнатной температуре для последующего использования. Сразу после шага центрифугации и без возбуждения трубок слейте супернатант, не нарушая нейтрофиловые гранулы.
повторное посасывания каждой ячейки гранулы в 10 миллилитров клеточной культуры среды при комнатной температуре, мягко пипетки клеток вверх и вниз в четыре раза. Этикетка одной трубки DMSO и другой трубки MLi-2. В DMSO помечены трубки добавить 10 микролитер DMSO и добавить 10 микролитров 200 микромолящих MLi-2 фондовый раствор, мягко трубы вверх и вниз, чтобы смешать.
Инкубировать образцы в течение 30 минут при комнатной температуре. Смешайте осторожно инверсии каждые 10 минут в инкубационный период. В течение 30 минут LRRK2 киназы ингибитор лечения удалить 0,5 моляра DIFP фондовый раствор из минус 80 градусов морозильник и место в дым капот на льду.
Затем перемести один миллиграмм на миллилитр раствор microcystin-LR из морозильной камеры минус 80 градусов и поместите при комнатной температуре в оттепель. Разморозить алицит, 0,25 миллилитра буфера лиза, вынюхав его из морозильной камеры, дать разморозить при комнатной температуре, а затем поместить на лед для последующего использования. Подготовь один миллилитр среды RPMI, содержащий один микролитр DMSO, назови это DMSO Resuspension Buffer.
Подготовь один миллилитр среды RPMI, содержащий один микролитр из 200 микромолейных MLi-2 или альтернативный ингибитор киназы LRRK2, и назовите этот MLi-2 Resuspension Buffer. После 30-минутного инкубационный период центрифуга обе трубки при 335G в течение пяти минут, как и раньше. Тщательно отбросьте супернатант в каждой трубке, не нарушая нейтрофиловые гранулы.
Для dmSO помечены трубки, мягко повторно гранулы в один миллилитр DMSO Resuspension Buffer. А для MLi-2 помечены трубки, повторно гранулы в один миллилитр MLi-2 Resuspension Buffer. Передача повторного перерасхода клеточных гранул соответствующим центрифугации труб помечены DMSO и MLi-2 и центрифуги обе трубки на 335G в течение трех минут.
Во время шага центрифугации подготовьтесь к буферу лиза. В дымовой капот аккуратно добавьте 0,25 микролитров раствора 0,5 моляра DIFP, а также 0,25 микролитров по 1 миллиграмму на миллилитр микроцистин-LR в буфер лиза 0,25 миллилитров. Смешать и оставить на льду до использования.
Сразу после центрифугации тщательно и полностью удалите все супернатанты пипеткой, не нарушая нейтрофиловую гранулу, и поместите трубки на лед. Немедленно добавьте 100 микролитров буфера лиза, содержащего DIFP и микроцистин-LR, в каждую трубку. Используя пипетки от 100 до 200 микролитров, повторно помещики гранулы клетки путем трубопроводов вверх и вниз около пяти до 10 раз.
Лежате клетки на льду в течение 10 минут. Затем, центрифуги трубки на 20000 раз G в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию, чтобы удалить клеточный мусор. Передача супернатанта DMSO и MLi-2, содержащего литрофил, в новые центрифугированные трубки.
Отбросьте гранулы мусора. Лизераты нейтрофила теперь готовы к использованию или могут быть заморожены в жидком азоте и хранятся при температуре минус 80 градусов для будущего анализа. Используя данные общедоступной базы данных импорта, этот график показывает, что обилие белков LRRK2 и Rab10 особенно высоко в нейтрофилах и моноцитах периферической крови человека.
Изоляция нейтрофилов периферической крови человека с помощью этой процедуры приводит к высокому нечистому выходу клеток. Таблица в верхней части показывает общее количество клеток, изолированных от 10 миллилитров периферической крови от трех здоровых доноров. Также показаны чистота и жизнеспособность изолированных клеток, а также общий урожай лизолята белка.
После лечения ингибитором киназы LRRK2, MLi-2, нейтрофилы лизлируются в присутствии мощного ингибитора протеазы, DIFP. Для фигуры B на левой стороне, 10 микрограммов экстрактов целых клеток на полосу подверглись мультиплексу количественного иммуноблотного анализа с указанными антителами. Рисунок справа, C, демонстрирует важность DIFP для предотвращения протеолитической деградации, в частности большого белка LRRK2.
Для сравнения, высокие концентрации ПМФУ сами по себе менее эффективны. Здесь по-прежнему по сравнению с контролем контроля LRRK2 фосфорилирование Rab10 значительно увеличивается примерно в три раза в периферических нейтрофилов крови, полученных от пациентов с наследственной болезнью Паркинсона, укрывательство гетерозиготной мутации VPS35 D620N. Верхний график показывает мультиплекс иммуноблот анализа и нижней, количественной оценки из них.
Это говорит о том, что мутация VPS35 D620N активирует путь активности КИНАЗы LRRK2 с помощью пока неизвестного механизма. Таким образом, мы представляем поверхностный и надежный анализ для измерения активности LRRK2 киназы пути путем мониторинга Rab фосфорилирования белка, таких как Rab10, в человека периферических полученных нейтрофилов, этот метод позволяет нам оценить активность пути LRRK2 и определить, как мутации, состояния болезней или ингибиторы модулировать LRRK2 пути деятельности.
