Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы представить оптимизированный экспериментальный подход к изоляции эмбриональных тканей от перепелиных и куриных эмбрионов. С помощью этого метода мы получаем чистые эмбриональные ткани, которые могут быть использованы в исследованиях экспрессии генов и функциональных анализах. Ткани из перепелиных и куриных эмбрионов изолированы микрохирургией и подлежат витротическому пищеварению при сохранении его биологических свойств.
После изоляции трехмерные сохранившиеся ткани могут быть использованы для анализа топографических моделей экспрессии генов высокого разрешения. Этот подход особенно полезен для детализации экспрессии генов на месте на эмбриональных территориях, которые в противном случае недоступны обычными методами. Кроме того, подходы к анализу транскриптома также могут применяться в изолированных тканях, не требуя генетических маркеров, обеспечивая при этом специфический для тканей высокий пропускной оминый анализ.
Кроме того, изолированные ткани обоих видов могут быть связаны с органотипическим анализом in vitro в течение 48 часов. Такой подход позволяет изучать взаимодействия тканей, так как перепелиные и куриные клетки могут подвергаться дискриминации по отдельным ядерным особенностям и молекулярным маркерам. Способность тканей культуры формировать органы может быть дополнительно проверена в анализе ово.
Таким образом, этот метод является полезным инструментом для изучения сложных взаимодействий тканей в процессах развития с высокодинамические спациальные изменения, а также может помочь выявить потенциал конкретных эмбриональных территорий для формирования органов. В качестве примера в настоящем описано образование перепелино-куриного химерного тимуса из изолированных эмбриональных тканей. Во-первых, эндодерм третьего и четвертого фарингальных мешков, перспективный тимический рудимент изолирован от фарингальной области перепелиных эмбрионов с тремя днями развития.
Затем эта ткань ассоциируется с мезенхимом, способным поддерживать его развитие, мезодермом соматоплеуры. Наконец, гетероспецифическая ассоциация тканей культурируется в пробирке и в ово, чтобы сформировать химерный тимус. Выполните все процедуры манипуляции яйцом в стерильных условиях с помощью горизонтального ламинарного потока капота и стерилизованных инструментов и материалов.
Оплодотворенные перепелиные яйца инкубировались воздушной камерой вверх. Для начала удалите перепелиные яйца из инкубатора. Приготовьте большую боросиликатную стеклянную чашу, наполненную холодным PBS.
С изогнутыми ножницами, нажмите и вырезать круглое отверстие в оболочке перепелиного яйца с трех дней инкубации. Сделайте отверстие в противоположной стороне яйца тупой, и передать желток в миску с холодной PBS. Удалите эмбрион из желтка, разрезая вителлиновую мембрану внешне на экстраэмбрионные сосуды.
С помощью тонких типсов перенесите эмбрион в небольшую миску, наполненную холодным PBS, затем переместите эмбрион в чашку Петри с черным основанием с скиммером. Удалите фарингеальной области, содержащей третий и четвертый фарингальные мешки, как описано в предыдущем Jove SPA перевязки. Затем перенесите третью и четвертую область фарингальной арки в стакан, наполненный холодным панкреатином и инкубировать в течение одного часа, на льду, для ферментативного пищеварения.
Отметим, что инкубационный период энзиматичного пищеварения зависит от стадии развития. Поместите стеклянную тарелку под стерео микроскоп и изолируйте эндодерм от третьей и четвертой области фарингальной арки, используя два микро-скальпеля в держателе. Первое место фарингальной области с спинной стороны вверх, показывая внутренне эндодерма и эктодерма во внешней поверхности.
Наблюдайте за эктодермом, эндодермом, мезенхимом, сердечной трубкой и вентраловой частью нервной трубки. Удалите нервную трубку и мезодерм, прикрепленный к спинной поверхности фарингального эндодерма. Наблюдайте за эндодермом глотки, четвертым и третьим фарингальными мешками и сердечной трубкой.
С спинной стороны вверх, тщательно отсоединить и удалить мезенхим между фарингальными арками и подвергать фарингеальные мешки. Выполните эту процедуру на другой стороне фарингеальной области. Удалите мезенхим, прикрепленный к самой задней части эндодерма, и наблюдайте за четвертым фарингальным мешком.
С задней стороны вверх, наблюдать как левый, так и правый четвертый фарингеальный мешки. Продолжить, удалив мезенхим прилагается к наиболее задней части эндодерма и второй мешок. Удалите сердечную трубку и мезенхим, окружающий внутренние сумки.
С брюшной стороны вверх, наблюдать глотки эндодерма, и правая сторона второй фарингеальной арки. На этом этапе должен быть виден эндодерм рудимента щитовидной железы. Отсоедините эктодерм второй и третьей фарингальных арок и аккуратно удалите мезенхим арки.
Наблюдайте за удалением мезенхима второй фарингальной арки с правой стороны. Обратите внимание на расположение четвертого и третьего мешков и рудимента щитовидной железы. Удалите останки в мезенхимальные клетки, прикрепленные к фарингальным мешкам.
Наблюдайте за третьим и четвертым мешками правой стороны и четвертым мешком с левой стороны. Повторите мезенхим отряд левой стороны. Наблюдайте теперь третий мешок левой стороны.
Наблюдайте мезенхимный отряд второй арки с левой стороны. Обратите внимание, что все поверхности и растворы должны быть холодными во время этой процедуры. Изменение на новый холодный раствор поджелудочной железы и блюдо в случае принятия долгое время, чтобы вскрыть ткани.
Наконец, сделать поперечный разрез между вторым и третьим фарингеальных мешков, чтобы удалить второй мешок и зачаток щитовидной железы. На данный момент, изолированные эндодерм состоит из третьего и четвертого фарингеальных мешков и задней оконечности глотки. Удалите остатки отдельного мезенхима с помощью двух микро-скальпелей.
Перенесите изолированный эндодерм в стеклянную тарелку, наполненную холодной сывороткой крупного рогатого скота плода, и держите ее на льду во время подготовки пробирки. Яйца были помещены в горизонтальное положение, а верхняя сторона отмечена для использования древесного угля. Для начала удалите яйца из инкубатора.
С изогнутыми ножницами, открыть небольшое отверстие в оболочке, вставить иглу, и аспирировать два миллилитров альбумин с 10 миллилитров шприца. Откройте круглое отверстие в отмеченной области оболочки и вырежьте вителлиновую мембрану внешне для дополнительных эмбриональных сосудов, удерживая эмбрион тонкими типсами. Под стерео микроскопом поместите эмбрион в чашку Петри с черным основанием, содержащим холодный PBS.
Используйте четыре булавки насекомых, чтобы держать эмбрион на дне пластины. Поместите булавки в экстраэмбрионную область, образуя квадратную форму. Выполните два разреза между сомитами 19 и 24 поперечно к оси эмбриона и пересечения эмбриона.
Отпустите этот раздел, разрезая маргинальные эмбриональные края. Наблюдайте за боковой пластиной, нервной трубкой и сомитами. Аспирировать и передавать ткани в стеклянное блюдо, наполненное холодным панкреатином.
Инкубировать в течение 30 минут на льду для энзиматической пищеварения. Под стерео микроскопом изолируйте мезодерм от окружающих тканей, используя два микро-скальпеля в держателях. Наблюдайте за мезодермом соматоплеуры, спланхноплурой, нервной трубкой и эктодермом.
Во-первых, удалите эктодерм на поверхности. Наблюдайте за мезодермом соматоплеуры, отмежевав от эктодерма. Затем осторожно отсоедините вентрализованную спланхноплеуру от соматоплеуры.
Соблюдайте правый боковой мезодерм соматоплеуры. Отпустите его, разрезая его параллельным движением к нервной трубке. Обратите внимание, что все поверхности и растворы должны быть холодными во время этой процедуры.
Изменение на новый холодный раствор поджелудочной железы и блюдо в случае принятия долгое время, чтобы вскрыть ткани. Наблюдайте за левым боковой мезодермом соматоплеуры, сомитов, нервной трубки и эктодерма. Повторите мезодерм релиз этой стороны.
Сделайте медленные движения с помощью микро-скальпеля. Открытые внеклеточные матричные белки проходят через ткани и инструменты, предотвращая движения жидкости. Аккуратно разрежьте соматоплеуру параллельным движением к нервной трубке.
Перенесите изолированный мезодерм в стеклянную тарелку, наполненную холодной сывороткой крупного рогатого скота плода, и держите ее на льду во время подготовки анализа in vitro. Поместите тонкую сетчатую металлическую решетку в чашку Петри и заполните культурной средой. Удалите лишние жидкости, чтобы выровнять средней поверхности с верхней части решетки.
С помощью тонких типсов окуните мембранный фильтр в культурную среду и аккуратно поместите его на верхнюю часть решетки, чтобы иметь поверхность в контакте с ней. Под стерео микроскопом перенесите изолированный эндодерм из стеклянной тарелки в мембранный фильтр, нежно сдвинув с помощью шпателя и тонких типсов. Повторите эту процедуру для изолированного мезодерма.
С помощью микро-скальпеля, смешать ткани, чтобы максимизировать его ассоциации. Тщательно поместите связанные ткани во влажный инкубатор при 37 градусах с 5%CO2 в течение 48 часов. После инкубации, привить ткани культуры на мембрану типа кориолан и позволить ему развиваться в овале в течение еще 10 дней, чтобы завершить формирование органов, как описано ранее.
Вот ретикулярный метод, который позволяет изоляции птичьих эмбриональных тканей, которые будут использоваться в различных экспериментальных подходов. В качестве примера, экспрессия генов, как известно, участвует в формировании фарингальных мешков были также оценены изолированные эндодерм, содержащие второй, третий и четвертый фарингальные мешки из эмбрионов курицы в эмбриональный день три с половиной по всему горе на месте гибридизации. Выражение Sonic Hedgehog было обнаружено в эндодерме центральной глотки и исключено из мешков, в то время как BMP7 был выражен в эндодерме второго и третьего фарингеальных мешков и исключен из центральной глотки и четвертого фарингеального мешка.
Изолированные ткани также могут быть пробирки, специально связанные в пробирке в течение 48 часов, трансплантат на мембрану типа кориолан, и позволило развиваться в течение еще 10 дней. Экспланты могут быть проанализированы с помощью традиционной гистологии и иммуногистохимии. Некоторые репрезентативные результаты ассоциации перепела эндодерм из третьего и четвертого фарингеальных мешков с куриным somatopleura мезодерм являются следующие-Графты показали полностью сформированный химерный тимус с перепела производных тимических эпителиальных клеток положительный для ККПН и куриных лимфоидных клеток.
Кроме того, цитокератин положительный тимический эпителий показал нормальные морфологические особенности, показывая типичную ретикулярную архитектуру. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как изолировать перепелов и куриных эмбриональных тканей, которые могут быть использованы в исследованиях экспрессии генов и путем формирования химерных органов также может помочь расшифровать сложность генетики органов.
