Одним из преимуществ этого протокола является то, что лист червя прост в обращении. Лист имеет особенности, которые предотвращают высыхание, что позволяет проводить облучение микролучей живым животным, выполнять несколько поведенческих анализов и долгосрочное наблюдение. Микрофлюидные каналы в этом листе червя открыты, что облегчает сбор животных.
Эти листы червя также могут быть использованы повторно, что делает их более экономичными. Когда мы разрабатывали эту технику, мы хотели облучить только часть животных с помощью микробуса под микроскопом. Поэтому нам нужны были четкие, очень тонкие чипсы, способные держать животных.
Для начала поместите тонкий, прозрачный лист на сцену для использования в качестве нижней пленки крышки. Аккуратно распоистите лист червя на нижней пленке крышки плоским пинцетом. Поместите по крайней мере три капли буферного раствора на поверхность 6-сантиметровой, необработавой чашки Петри.
Затем выберите несколько взрослых C.elegans с platina сборщик из культуры пластины. Перенесите животных в каплю с сборщиком платины и позвольте животным плавать в буфере, чтобы удалить любые бактерии. Вымойте животных в две отдельные капли и промыть животных в другой капле.
Затем поместите капельку буферного раствора на поверхность листа червя. Удалите вымытых животных из буферной капли и перенесите их в каплю на листе червя. Используйте плоские пинцеты, чтобы поместить пленку крышки PS над листом червя, и нажмите осторожно по каналам от одного конца листа к другому.
Или просто падение животных в капли и осторожно печать с крышкой пленки так капля распространяется между крышкой и червя листов с животными в канале. Подтвердите, что животные живы, проверяя движение с помощью микроскопа при увеличении в 1-2x. Завехать позиции животных и конкретно отметить количество канала, в котором заключено каждое животное, и положение каждого животного в канале.
Для сбора иммобилизации животных используйте плоские пинцеты, чтобы снять пленку с червя, а затем сбросить 10-15 микролитров буферного раствора на один из микрофлюидных каналов, ограждающих животных. Под стереомикроскопом наблюдайте за животными, когда они начинают вращаться. Затем используйте сборщик платины, чтобы забрать плавающих животных и передать их на анализ пластины.
После ограждения животных, как было позже продемонстрировано, наблюдать флуоресцентные пятна на животных с мукомольным микроскопом. Затем изображение распространения ионных волн кальция с помощью видео приобретения для наблюдения за динамической деятельности. Поместите использованный лист червя на шестиметровую чашку Петри и поместите на лист около 100 микролитров стерилизованной ультра-чистой воды.
Используйте пальцы в перчатках для распространения воды на поверхности листа и смыть любые загрязняющие вещества. Затем используйте одноразовые салфетки, чтобы удалить влагу из листа червя. Выложить пять миллилитров 70% этанола в чашку Петри и использовать пальцы в перчатках для распространения этанола по листу червя.
Наконец, после того, как лист высохнет, поместите лист на стерильную чашку Петри и накройте крышкой. Используя этот протокол, была исследована пригодность различных кавер-фильмов. Существенной разницы в подвижности между контрольными животными и животными, заключенными в микрофлюидные каналы с пленкой PS, не было.
В отличие от этого, подвижность была значительно снижена у животных, заключенных под крышкой стекла. Значительно снизилась подвижность животных, заключенных в пленку для домашних животных. Важно тщательно подбирать пленки для герметизации микрофлюидных каналов.
Используя этот протокол, мы оценили пригодность различных пленок покрытия с помощью анализа передвижения животных через три часа после иммобилизации на чипе. Используя эту технику, мы намеревались разработать ультратонкий влажный чип только для облучения микролучей. Тем не менее, эти листы червей уже были использованы для визуализации и поведенческих анализов за пределами их первоначального применения.
