Uma vantagem deste protocolo é que a folha de vermes é fácil de manusear. A folha possui características que impedem a secagem, permitindo-nos realizar a irradiação de micróbios para animais vivos, realizar vários ensaios comportamentais e observação a longo prazo. Os canais microfluidos nesta folha de vermes estão abertos, facilitando a coleta de animais.
Essas folhas de vermes também podem ser usadas repetidamente, tornando-as mais econômicas. Quando estávamos desenvolvendo essa técnica, queríamos irradiar apenas uma parte dos animais com um micróbio sob um microscópio. Então precisávamos de fichas claras e finas capazes de segurar os animais.
Para começar, coloque uma folha fina e transparente no palco para ser usada como uma foto de capa inferior. Posicione suavemente uma folha de vermes na tampa inferior com pinças planas. Coloque pelo menos três gotículas de solução tampão na superfície de uma placa de Petri de 6 centímetros, não tratada.
Em seguida, escolha vários C.elegans adultos com um catador platina de uma placa de cultura. Transfira os animais para uma gotícula com o colhedor de platina e permita que os animais nadem em tampão para remover qualquer bactéria. Lave os animais em duas gotículas separadas e enxágue os animais em outra gota.
Em seguida, coloque uma gota de solução tampão na superfície da folha de vermes. Remova os animais lavados da gotícula do buffer e transfira-os para uma gota na folha de vermes. Use pinças planas para colocar uma película de capa PS sobre a folha de vermes e pressione suavemente sobre os canais de uma extremidade da folha para a outra.
Ou simplesmente solte animais em gotículas e sele suavemente com o filme de capa para que a gota se espalhe entre a tampa e os lençóis de vermes com os animais dentro do canal. Confirme se os animais estão vivos verificando se há movimento com um microscópio na ampliação de 1-2x. Regissão das posições dos animais e observe especificamente o número do canal em que cada animal está fechado, e a posição de cada animal no canal.
Para coletar animais imobilizadores, use pinças planas para remover o filme de capa da folha de vermes e, em seguida, solte 10-15 microliters de solução tampão em um dos canais microfluidos que incluem os animais. Sob o estereótipo, observe os animais quando eles começam a girar. Em seguida, use o catador platina para pegar os animais de natação e transferi-los para uma placa de ensaio.
Após o acocluamento dos animais como demonstrado anteriormente, observe manchas fluorescentes nos animais com um microscópio de farinha. Em seguida, imagem propagação de ondas de íons de cálcio usando aquisição de vídeo para observar atividades dinâmicas. Coloque a folha de vermes usados em uma placa de petri de seis centímetros e coloque cerca de 100 microliters de água ultra-pura esterilizada na folha.
Use dedos enluvados para espalhar água na superfície da folha e lavar quaisquer contaminantes. Em seguida, use lenços descartáveis para remover a umidade da folha de vermes. Distribua cinco mililitros de 70% de etanol na placa de Petri e use dedos enluvados para espalhar o etanol sobre a folha de vermes.
Finalmente, depois que a folha estiver seca, coloque a folha em uma placa de Petri estéril e cubra. Usando este protocolo, a adequação de diferentes filmes de capa foi investigada. Não houve diferença significativa na motilidade entre animais de controle e animais envoltos em canais microfluidos com filme PS.
Em contraste, a motilidade foi significativamente reduzida em animais fechados sob um vidro de cobertura. A motilidade dos animais fechados com um filme de estimação também foi significativamente diminuída. É importante selecionar filmes de capa para a vedação de canais microfluidos cuidadosamente.
Usando este protocolo, avaliamos a adequação de diferentes filmes de capa através de ensaios de locomoção dos animais três horas após a imobilização no chip. Usando esta técnica, pretendemos desenvolver um chip de umidade ultrafina apenas para irradiação de micróbios. No entanto, essas folhas de vermes já foram usadas para imagens e ensaios comportamentais além de suas aplicações originais.
