Bu protokolün bir avantajı solucan sayfası işlemek kolay olmasıdır. Sayfa, kurumayı önleyen, yaşayan hayvanlara mikro ışınışın lama yapmamızı, çeşitli davranışsal tahliller yapmamızı ve uzun süreli gözlem yapmamızı sağlayan özelliklere sahiptir. Bu solucan yaprağındaki mikroakışkan kanallar açık, bu da hayvanları toplamayı kolaylaştırıyor.
Bu solucan yapraklar da tekrar tekrar kullanılabilir, onları daha ekonomik hale. Bu tekniği geliştirirken, mikroskop altında mikroışın olan hayvanların sadece bir kısmını ışınlamak istedik. Bu yüzden hayvanları tutabilecek berrak, çok ince çiplere ihtiyacımız vardı.
Başlamak için, bir alt kapak film olarak kullanmak için sahne üzerine ince, şeffaf bir levha yerleştirin. Solucan sayfasını alt kapak filmine düz cımbızla hafifçe yerleştirin. 6 santimetrelik, tedavi edilmeyen Petri kabının yüzeyine en az üç damla tampon çözelti yerleştirin.
Sonra, bir kültür plakabir platin toplayıcı ile birkaç yetişkin C.elegans seçin. Platin toplayıcı ile bir damlacık için hayvanları aktarın ve hayvanların herhangi bir bakteri kaldırmak için tampon yüzmek için izin. Hayvanları iki ayrı damlacıkta yıkayın ve hayvanları başka bir damlacıkta durula.
Daha sonra, solucan yaprağıyüzeyine tampon çözeltisi damlacıkları yerleştirin. Yıkanmış hayvanları tampon damlacıktan çıkarın ve solucan yaprağındaki bir damlacık için aktarın. Solucan sayfasının üzerine ps kapak filmi yerleştirmek için düz cımbız kullanın ve sayfanın bir ucundan diğerucuna kadar kanalların üzerine hafifçe basın.
Ya da sadece damlacık içine hayvanları bırakın ve yavaşça kapak filmi ile mühür böylece damlacık kanal içinde hayvanlar ile kapak ve solucan yaprak arasında yayılır. 1-2x büyütme de bir mikroskop ile hareket kontrol ederek hayvanların hayatta olduğunu doğrulayın. Hayvanların konumlarını kaydedin ve özellikle her hayvanın kapalı olduğu kanalın sayısını ve kanaldaki her hayvanın konumunu not edin.
Immobilizing hayvanları toplamak için, solucan levha dan kapak filmi kaldırmak için düz cımbız kullanın, sonra hayvanları çevreleyen mikroakışkan kanallardan birine tampon çözeltisi 10-15 mikrolitre bırakın. Stereomikroskop altında, dönmeye başlayan hayvanları gözlemleyin. Sonra yüzen hayvanları almak ve bir yüzer plaka onları aktarmak için platina picker kullanın.
Hayvanları daha önce gösterildiği gibi çevreledikten sonra, floresan noktaları unescence mikroskobu ile gözlemleyin. Daha sonra dinamik faaliyetleri gözlemlemek için video edinimi kullanarak kalsiyum iyon dalgası yayılımı görüntü. Altı santimetre petri-çanak üzerine kullanılan solucan yaprağı yerleştirin ve levha üzerine sterilize ultra saf su yaklaşık 100 mikrolitre yerleştirin.
Sac yüzeyine su yaymak ve herhangi bir kirletici leri yıkamak için eldivenli parmakları kullanın. Ardından, solucan yaprağındaki nemi temizlemek için tek kullanımlık mendiller kullanın. Petri-çanak içine% 70 etanol beş mililitre dağıtın ve solucan levha üzerine etanol yaymak için eldivenli parmakları kullanın.
Son olarak, levha kurudıktan sonra, steril bir Petri-çanak ve kapak üzerine levha yerleştirin. Bu protokol kullanılarak farklı kapak filmlerinin uygunluğu araştırılmıştır. PS filmi ile mikroakışkan kanallarda yer alan kontrol hayvanları ile hayvanlar arasında hareketlilik arasında anlamlı bir fark yoktu.
Buna karşılık, bir kapak cam altında kapalı hayvanlarda hareketlilik önemli ölçüde azaltıldı. Evcil hayvan filmi ile kapatılan hayvanların hareketliliği de önemli ölçüde azaldı. Mikroakışkan kanalların sızdırmazlığı için kapak filmlerini dikkatle seçmek önemlidir.
Bu protokolü kullanarak, çipli immobilizasyondan üç saat sonra hayvanların hareket teşrisleri ile farklı kapak filmlerinin uygunluğunu değerlendirdik. Bu tekniği kullanarak, sadece mikro ışınlama için ultra ince ıslak yonga geliştirmeyi amaçladık. Ancak, bu solucan sayfaları zaten orijinal uygulamaları ötesinde görüntüleme ve davranışsal tahliller için kullanılmıştır.
