Этот метод может выявить пространственные закономерности экспрессии бактериальных генов и стратегии физиологической адаптации к микросредам тканей, которые теряются при усредне по всей популяции в тканях. С помощью этого метода могут быть обнаружены потенциальные неоднородности, которые должны быть рассмотрены при выявлении новых бактериальных путей и белков, которые будут направлены на противовирусность или антибактериальные соединения. Начните с полос S.aureus штаммов интереса на крови агар пластин из замороженных запасов глицерола и инкубации пластин при 37 градусов по Цельсию в течение 16 до 24 часов, чтобы подтвердить их гемолитических фенотипов на основе их способности лизировать красные кровяные тельца и сформировать четкие прозрачные зоны.
Прививка одной колонии изолирует каждого штамма в четыре миллилитров триптического соевого бульона, или TSB, в стерильных стеклянных трубках и вращать трубки при 37 градусах по Цельсию в течение 16 до 24 часов в трубке ролика под углом около 70 градусов и 70 оборотов в минуту. На следующее утро измерить оптическую плотность на 600 нанометров, или OD 600, культур на спектрофотометре и разбавить клетки OD 600 из 0,05 в 25 миллилитров стерильных TSB на пять к одному колбу к соотношению громкости в 125 миллилитров Delong колбы. Инкубировать культуры в 37 градусов по Цельсию водяной бане на 280 вращений в минуту и урожай клеток во время экспоненциальной фазы.
Пеллет клетки центрифугации и мыть клетки два раза в равном объеме стерильных PBS. Затем повторное использование клеток в свежем PBS в один раз от 10 до восьмой колонии формирования единиц на миллилитр концентрации для их последующей инъекции в животное-реципиента. В соответствующей экспериментальной точке конца, урожай почек, сердца, печени, легких и селезенки в 15 миллилитров полипропилена трубки, содержащие 10%buffered формалин для 24 до 48 часов инкубации в темноте при комнатной температуре с нежной тряски или вращения.
В конце фиксации встраиваем органы в чищающую ткань замораживания среды для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Используйте криостат, чтобы приобрести 10 микрометров толщиной секций тканей и высушить разделы на отдельных предварительно очищенных заряженных стеклянных слайдов в течение 20 минут в темноте, прежде чем применять жесткий монтаж среды дополняется DAPI. Затем нанесите крышку скользит и вылечить слайды при комнатной температуре на ночь перед передачей образцов в долгосрочное хранение при четырех градусах по Цельсию.
Для выявления повреждений в образцах, поместите слайд на стадии лазерного сканирования конфокального микроскопа и использовать соответствующую цель для визуализации отдельных клеток для получения изображений поражений. Для измерения интенсивности флуоресценции в конфокальных изображениях откройте изображение в ImageJ и отрегулируйте яркость и контрастность, чтобы правильно визуализировать сигнал флуоресценции поражения. Определите область интереса с помощью инструмента выбора полигонов и добавьте рентабельность инвестиций в менеджер roi под вкладкой Edit в ImageJ.
Выберите редактировать, затем выбор, и, наконец, добавить к менеджеру. Затем переименуем ROI и обозначим соответствующее изображение. Чтобы определить центроид, откройте вкладку Анализ и выберите область, среднее серое значение, центроид и предел порога.
Извлекайте центроидное значение интенсивности флуоресценции или измерять средняя интенсивность флуоресценции в данной области поражения на единицу. Этого можно достичь с помощью функции порогового значения для при необходимости установить нижние и верхние пределы флуоресценции. Экспорт данных в файл Excel и подготовка столбца, указывающего на средняю интенсивность флуоресценции в области единицы для периферии и ядра.
Для расчета средней интенсивности флуоресценции на единицу площади периферии и ядра вручную определяют верхние и нижние пределы порогового значения. Стафилококк золотистый термонуклеаза GFP слияния флуоресценции в среднем почти в девять раз выше в клетках, несущих ген синтеза, чем в клетках, не несущих репортер слияния. Аналогичным образом, тандем димерик tomato слияния флуоресценции примерно в шесть раз выше, чем нулевой репортер контроля.
Характер деятельности репортера может быть подтвержден цитометрией потока с жероденатами тканей. Хотя различия в раз флуоресценции, как правило, ниже. Вариации в измерениях флуоресценции могут быть вызваны неоднородным выражением репортеров.
Например, в этих репрезентативных пробах было отмечено, что некоторые повреждения выражаются либо одним, либо обоими репортерами в пределах примерно 100 микрометров расстояния в одном и том же образце ткани. Изучение активности репортера в одном разрешении клеток в стафилококковых сообществах abcess показывает пространственное регулирование экспрессии термонуклеазы стафилококка в абсцессах, связанных с сильным окрашивание DAPI, вероятно, связанных с образованием и высвобождением нейтрофиловых внеклеточных ловушек. Например, значительно выше стафилококк ауреус термонуклеазы GFP фьюжн флуоресценции наблюдается во внутренней части ядра стафилококковой abcess сообщества по сравнению с локализованными на периферии.
В той же abcess, картина для тандема димерик tomato слияния флуоресценции, как представляется, инвертированы. Однако картина в этом эксперименте не была статистически значимой. Получение нетронутыми крио-встроенных вскрытий имеет жизненно важное значение для анализа изображения флуоресценции и должно быть сделано тщательно.
Сортировка бактериальных клеток для захвата субнаселения, выражают слияние в той или иной степени, в сочетании с анализом РНК-Сек может осветить геном широкие изменения в транскриптоме. Позаботьтесь при работе с формалином, как это канцероген и может вызвать раздражение кожи, аллергические реакции, или повреждения глаз при прямом воздействии. Создание мутантных производных штаммов, несущих флуоресцентные репортеры, представляющие интерес, может помочь выявить генетическую основу наблюдаемых пространственных регуляторных моделей.
