이 방법은 조직의 전체 인구에 걸쳐 평균 될 때 손실되는 조직 마이크로 환경을 호스트하는 생리적 적응을위한 세균성 유전자 발현 및 전략의 공간 패턴을 공개 할 수 있습니다. 이 기술로 잠재적이기적인 이질성은 항보성 또는 항균 화합물에 의해 표적으로 하는 새로운 세균성 통로 및 단백질을 확인할 때 고려되어야 한다는 것을 검출될 수 있습니다. 냉동 글리세롤 육수에서 혈액 천서 판에 대한 관심의 S.aureus 균주를 줄이고 적혈구를 lyse와 명확한 투명 영역을 형성하는 능력에 따라 자신의 용혈 표현형을 확인하기 위해 16 ~ 24 시간 동안 37 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하여 시작합니다.
살균 대두 국물, 또는 TSB의 4 밀리리터에 각 변형의 각 변형을 접종하고 약 70도 각도에서 튜브 롤러에서 16 ~ 24 시간 동안 섭씨 37도에서 튜브를 회전약 70도 각도와 분당 70 회전. 다음날 아침 분광계의 배양600 나노미터 또는 OD 600의 광학 밀도를 측정하고 125 밀리리터 Delong 플라스크에서 5 대 1 플라스크대 부피 비율로 멸균 TSB의 25 밀리리터에서 0.05의 OD 600으로 세포를 희석시. 분당 280회전에서 37도의 섭씨 수조에서 배양물을 배양하고 기하급수적인 단계에서 세포를 수확한다.
원심분리에 의해 세포를 펠렛하고 멸균 PBS의 동등한 부피로 세포를 두 번 세척한다. 그런 다음 신선한 PBS에서 세포를 수신자 동물로 후속 주입을 위해 밀리리터 농도당 밀리리터 농도당 8번째 식민지 형성 단위로 1배씩 재연한다. 적절한 실험 종점에서 신장, 심장, 간, 폐 및 비장을 15 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브로 수확하여 10% 완충된 포르말린 튜브를 실내 온도에서 24~48시간 배양하여 부드러운 흔들림이나 회전을 합니다.
고정의 끝에서, 영하 80도에서 저장을위한 명확한 조직 동결 배지에 장기를 포함. 저온측정기를 사용하여 10마이크로미터 두께의 조직 섹션을 획득하고 DAPI로 보충된 단단한 장착 매체를 적용하기 전에 어둠 속에서 20 분 동안 미리 청소 된 충전 유리 슬라이드의 섹션을 건조시키십시오. 그런 다음 덮개 전표를 적용하고 하룻밤 동안 실온에서 슬라이드를 치료한 후 샘플을 섭씨 4도에서 장기 보관으로 옮깁니다.
샘플 내병변을 식별하려면 레이저 스캐닝 공초점 현미경의 단계에 슬라이드를 배치하고 개별 세포를 시각화하여 병변의 이미지를 획득하는 적절한 목표를 사용합니다. 공초점 이미지 내에서 형광 강도를 측정하려면 ImageJ에서 이미지를 열고 밝기와 대비를 조정하여 병변의 형광 신호를 적절하게 시각화합니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 관심 영역을 정의하고 ImageJ의 편집 탭 에서 ROI 관리자에 ROI를 추가합니다.
편집을 선택한 다음 선택한 다음 마지막으로 관리자에 추가합니다. 다음으로 ROI의 이름을 변경하여 각 이미지에 레이블을 지정합니다. 센트로이드를 정의하려면 분석 탭을 열고 영역, 평균 회색 값, 센트로이드 및 임계값으로 제한을 선택합니다.
원중형형광 강도 값을 추출하거나 단위 영역당 주어진 병변에서 평균 형광 강도를 측정한다. 이는 임계값 을 사용하여 필요에 따라 하부 및 상부 형광 제한을 설정함으로써 달성 될 수 있습니다. 데이터를 Excel 파일로 내보내고 주변 및 코어에 대한 단위 영역당 평균 형광 강도를 나타내는 열을 준비합니다.
주변 및 코어의 단위 영역당 평균 형광 강도를 계산하려면 임계값의 상한 및 하한을 수동으로 정의합니다. 황색포도상구균 열핵증 GFP 융합 형광은 기자 융합을 운반하지 않는 세포보다 융합 유전자를 운반하는 세포에서 평균 거의 9배 더 높다. 마찬가지로, 탠덤 디메릭 토마토 융합 형광은 null 리포터 제어보다 약 6배 높다.
리포터 활동의 패턴은 조직 균질화로 세포측정을 유동하여 확인할 수 있다. 형광의 접이식 차이는 일반적으로 낮습니다. 형광 측정의 변화는 기자의 이기종 발현 때문일 수 있다.
예를 들어, 이들 대표적인 샘플에서 일부 병변은 동일한 조직 샘플에서 약 100 마이크로미터 의 거리 내에서 기자 중 하나 또는 둘 다 발현되는 것을 관찰하였다. 황색포도상구균 abcess 지역 사회에서 단일 세포 해상도로 기자 활동을 검사하면 강한 DAPI 염색으로 외딴 농양에서 포도상 구균 오레우스 열뉴클레인 발현의 공간 적 조절이 밝혀지며 호중구 외세포 트랩의 형성 및 방출과 관련이 있습니다. 예를 들어, 상당히 높은 포도상구균 아우레우스 열핵증 GFP 융합 형광은 주변 지역에 국한된 것에 비해 포도상 구균 abcess 커뮤니티의 내부 코어에서 관찰된다.
같은 abcess에서, 탠덤 희미한 토마토 융합 형광에 대한 패턴은 반전 된 것으로 보인다. 그러나, 본 실험의 패턴은 통계적으로 유의하지 않았다. 동결에 내장된 해부를 얻는 것은 형광 이미지 분석에 필수적이며 신중하게 수행해야 합니다.
RNA-Seq 분석과 결합하여 다양한 범위로 융합을 발현하는 하위 집단을 포착하기 위해 세균 세포의 분류는 전사에 있는 게놈 넓은 변화를 조명할 수 있었다. 발암 물질이기 때문에 포르말린으로 작업할 때주의해야 하며 직접 노출시 피부 자극, 알레르기 반응 또는 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 관심있는 형광 기자를 운반하는 균주의 돌연변이 유도체를 생성하는 것은 관찰 된 공간 조절 패턴에 대한 유전 적 기초를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.
