Este método pode revelar padrões espaciais de expressão genética bacteriana e estratégias de adaptação fisiológica aos microambientais de tecido hospedeiro que são perdidos quando em média em toda a população em tecidos. Com essa técnica podem ser detectadas potenciais heterogeneidades que devem ser consideradas ao identificar novas vias bacterianas e proteínas a serem alvo de antivirulência ou compostos antibacterianos. Comece por estirpes de S.aureus de interesse em placas de ágar de sangue de um estoque de glicerol congelado e incubando as placas a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas para confirmar seus fenótipos hemollíticos com base em sua capacidade de lise de glóbulos vermelhos e formar zonas transparentes claras.
Inocular isolados de uma única colônia de cada cepa em quatro mililitros de caldo de soja tripptic, ou TSB, em tubos de vidro estéreis e girar os tubos a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas em um rolo de tubo em um ângulo de aproximadamente 70 graus e 70 rotações por minuto. Na manhã seguinte, meça a densidade óptica em 600 nanômetros, ou OD 600, das culturas em um espectógrafo e dilua as células a um OD 600 de 0,05 em 25 mililitros de TSB estéril em um frasco de cinco para um em uma razão de volume em 125 mililitros de frascos Delong. Incubar as culturas em um banho de água de 37 graus Celsius a 280 rotações por minuto e colher as células durante a fase exponencial.
Pelotar as células por centrifugação e lavar as células duas vezes em um volume igual de PBS estéril. Em seguida, resuspende as células em PBS fresco para uma vezes 10 a oitava colônia formando unidades por concentração mililitro para sua injeção subsequente em um animal receptor. No ponto final experimental apropriado, colde o rim, coração, fígado, pulmões e baço em tubos de polipropileno de 15 mililitros contendo formalina 10% tamponada para uma incubação de 24 a 48 horas no escuro à temperatura ambiente com agitação suave ou rotação.
No final da fixação, incorpore os órgãos em meio de congelamento de tecido claro para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Use um criostat para adquirir seções de tecido de 10 micrômetros de espessura e seque as seções em lâminas de vidro carregadas pré-limpas individuais por 20 minutos no escuro antes de aplicar o meio de montagem dura complementado com DAPI. Em seguida, aplique deslizamentos de cobertura e cure os slides à temperatura ambiente durante a noite antes de transferir as amostras para armazenamento a longo prazo a quatro graus Celsius.
Para identificar lesões dentro das amostras, coloque um slide no estágio de um microscópio confocal de varredura a laser e use um objetivo apropriado para visualizar células individuais para adquirir imagens das lesões. Para medir as intensidades de fluorescência dentro das imagens confocal, abra uma imagem no ImageJ e ajuste o brilho e contraste para visualizar adequadamente o sinal de fluorescência da lesão. Defina a região de interesse usando a ferramenta seleções de polígonos e adicione o ROI ao gerenciador de ROI na guia Editar no ImageJ.
Selecione Editar, depois Selecionar e, finalmente, Adicionar ao gerente. Em seguida, renomeie o ROI e rotule a respectiva imagem. Para definir o centroid, abra a guia Analisar e selecione Área, Valor Cinza Médio, Centroid e Limite ao Limite.
Extrair o valor da intensidade da fluorescência centroide ou medir a intensidade média de fluorescência em uma determinada lesão por área unitária. Isso pode ser alcançado usando a função de limiar para definir os limites de fluorescência inferior e superior, conforme necessário. Exporte os dados para um arquivo Excel e prepare uma coluna indicando a intensidade média de fluorescência por unidade para a periferia e o núcleo.
Para calcular as intensidades médias de fluorescência por unidade na periferia e no núcleo, defina manualmente os limites superiores e inferiores do limiar. Staphylococcus aureus thermonuclease GFP fusion fluorescence é, em média, quase nove vezes maior em células que carregam o gene de fusão do que em células que não carregam a fusão repórter. Da mesma forma, a fluorescência de fusão de tomate dimeric tandem é cerca de seis vezes maior do que o controle nulo do repórter.
O padrão das atividades dos repórteres pode ser confirmado por citometria de fluxo com homogeneizadores teciduais. Embora as diferenças de dobra na fluorescência sejam tipicamente menores. Variações nas medidas de fluorescência podem ser devido à expressão heterogênea dos repórteres.
Por exemplo, nessas amostras representativas observou-se que algumas lesões expressavam uma ou ambas as repórteres dentro de aproximadamente 100 micrômetros de distância na mesma amostra de tecido. Examinar a atividade do repórter para uma resolução de célula única em comunidades estafilocócicas abcess revela uma regulação espacial da expressão estaphylococcus aureus termonuclease em abscessos circunscritos com forte coloração da DAPI, provavelmente associada à formação e liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos. Por exemplo, a fluorescência de fusão de estafilococos aureus termonuclease GFP é observada no núcleo interno da comunidade staphylococcal abcess em comparação com localizada à periferia.
Na mesma abcess, o padrão para a fluorescência de fusão de tomate dimeric tandem parece ser invertido. No entanto, o padrão neste experimento não foi estatisticamente significativo. A obtenção de dissecções crio-incorporadas intactas é vital para a análise de imagem da fluorescência e deve ser feita com cuidado.
A classificação das células bacterianas para capturar sub-populações expressando a fusão em diferentes extensões, juntamente com a análise de RNA-Seq poderia iluminar grandes mudanças no genoma no transcriptome. Tome cuidado ao trabalhar com formalina, pois é um cancerígeno e pode causar irritação na pele, reações alérgicas ou danos oculares após exposição direta. Gerar derivados mutantes de cepas que transportam repórteres fluorescentes de interesse pode ajudar a revelar a base genética para os padrões regulatórios espaciais observados.
