Diese Methode kann räumliche Muster der bakteriellen Genexpression und Strategien für die physiologische Anpassung an Wirtsgewebe-Mikroumgebungen aufdecken, die verloren gehen, wenn sie über die gesamte Population in Geweben gemittelt werden. Mit dieser Technik können potenzielle Heterogenitäten nachgewiesen werden, die bei der Identifizierung neuer bakterieller Pfade und Proteine berücksichtigt werden müssen, die durch Antivirulenz oder antibakterielle Verbindungen ins Visier genommen werden sollen. Beginnen Sie damit, S.aureus-Stämme von Interesse auf Blut-Agar-Platten aus einem gefrorenen Glyzerin-Bestand zu streifen und die Platten bei 37 Grad Celsius für 16 bis 24 Stunden zu bebrüten, um ihre hämolytischen Phänotypen auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, rote Blutkörperchen zu lysieren und klare transparente Zonen zu bilden, zu bestätigen.
In sterilen Glasröhren werden einzelne Kolonieisolate von jedem Stamm in vier Millilitern tryptischer Sojabrühe oder TSB geimpft und die Rohre 16 bis 24 Stunden in einer Rohrwalze in einem Winkel von etwa 70 Grad und 70 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius gedreht. Am nächsten Morgen messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600 der Kulturen auf einem Spektralphotometer und verdünnen Die Zellen auf eine OD 600 von 0,05 in 25 Milliliter steriler TSB bei einem Verhältnis von fünf zu einem Kolben zu Volumen in 125 Milliliter Delong-Flaschen. Inkubieren Sie die Kulturen in einem 37 Grad Celsius Wasserbad mit 280 Umdrehungen pro Minute und ernten Sie die Zellen während der exponentiellen Phase.
Pellet die Zellen durch Zentrifugation und waschen Sie die Zellen zweimal in einem gleichen Volumen von sterilen PBS. Dann setzen Sie die Zellen in frischem PBS auf ein mal 10 bis die achte Kolonie bildende Einheiten pro Milliliter Konzentration für ihre anschließende Injektion in ein Empfängertier aus. Am entsprechenden experimentellen Endpunkt die Niere, das Herz, die Leber, die Lunge und die Milz in 15 Milliliter Polypropylen-Röhren mit 10% gepuffertem Formalin für eine 24- bis 48-stündige Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln oder Drehen ernten.
Am Ende der Fixierung, einbetten Sie die Organe in klares Gewebe Gefriermedium für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius. Verwenden Sie einen Kryostat, um 10 Mikrometer dicke Gewebeabschnitte zu erfassen und die Abschnitte auf einzelnen vorgereinigten geladenen Glasschlitten für 20 Minuten im Dunkeln zu trocknen, bevor Sie hartes Montagemedium auftragen, das mit DAPI ergänzt wird. Dann Deckelscheine auftragen und die Dias bei Raumtemperatur über Nacht aushärten, bevor die Proben bei vier Grad Celsius in die Langzeitlagerung überführen.
Um Läsionen innerhalb der Proben zu identifizieren, legen Sie ein Dia auf die Bühne eines Laserscanning-Konfokalmikroskops und verwenden Sie ein geeignetes Ziel, um einzelne Zellen zu visualisieren, um Bilder der Läsionen zu erfassen. Um die Fluoreszenzintensitäten innerhalb der konfokalen Bilder zu messen, öffnen Sie ein Bild in ImageJ und passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an, um das Fluoreszenzsignal der Läsion richtig zu visualisieren. Definieren Sie den Interessenbereich, indem Sie das Polygonauswahlwerkzeug verwenden, und fügen Sie den ROI dem ROI-Manager unter der Registerkarte Bearbeiten in ImageJ hinzu.
Wählen Sie Bearbeiten, dann Auswahl und schließlich Hinzufügen zum Manager aus. Benennen Sie als Nächstes den ROI um, und beschriften Sie das entsprechende Bild. Um den Schwerpunkt zu definieren, öffnen Sie die Registerkarte Analysieren, und wählen Sie Bereich, mittlerer Grauwert, Schwerpunkt und Schwellenwert begrenzen aus.
Extrahieren Sie den Zentroidfluoreszenzintensitätswert oder messen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität in einer bestimmten Läsion pro Flächeneinheit. Dies kann erreicht werden, indem die Schwellenfunktion verwendet wird, um die unteren und oberen Fluoreszenzgrenzwerte bei Bedarf festzulegen. Exportieren Sie die Daten in eine Excel-Datei, und bereiten Sie eine Spalte vor, die die mittlere Fluoreszenzintensität pro Flächeneinheit für die Peripherie und den Kern angibt.
Um die mittleren Fluoreszenzintensitäten pro Flächeneinheit in der Peripherie und im Kern zu berechnen, definieren Sie manuell die oberen und unteren Grenzwerte der Schwellenwerte. Staphylococcus aureus Thermonuklease GFP-Fusionsfluoreszenz ist im Durchschnitt fast neunmal höher in Zellen, die das Fusionsgen tragen, als in Zellen, die die Reporterfusion nicht tragen. In ähnlicher Weise ist die Tandem-Dimer-Tomatenfusionsfluoreszenz etwa sechsmal höher als die Null-Reporter-Kontrolle.
Das Muster der Reporteraktivitäten kann durch Durchflusszytometrie mit Gewebehomogenaten bestätigt werden. Obwohl die Faltenunterschiede in der Fluoreszenz in der Regel geringer sind. Variationen der Fluoreszenzmessungen können auf eine heterogene Expression der Reporter zurückzuführen sein.
So wurde beispielsweise in diesen repräsentativen Proben beobachtet, dass einige Läsionen entweder einen oder beide der Reporter innerhalb von etwa 100 Mikrometern Entfernung in derselben Gewebeprobe ausdrückten. Die Untersuchung der Reporteraktivität zu einer Einzelzellauflösung in Staphylokokken-Abcess-Gemeinschaften zeigt eine räumliche Regulierung der Staphylococcus aureus Thermonuklease-Expression in Abszessen, die mit starker DAPI-Färbung begrenzt sind, wahrscheinlich im Zusammenhang mit der Bildung und Freisetzung von neutrophilen extrazellulären Fallen. Zum Beispiel wird im inneren Kern der Staphylokokken-Abcess-Gemeinschaft im Inneren im Inneren der Staphylokokken-Abcess-Gemeinschaft eine signifikant höhere Staphylococcus aureus-Thermonuklease-GFP-Fusionsfluoreszenz beobachtet als lokalisiert in die Peripherie.
In der gleichen Abcess scheint das Muster für die Tandem-Dimer-Tomatenfusionsfluoreszenz invertiert zu sein. Das Muster in diesem Experiment war jedoch statistisch nicht signifikant. Die Beschaffung intakter kryo-eingebetteter Sezieren ist für die Fluoreszenzbildanalyse von entscheidender Bedeutung und sollte sorgfältig durchgeführt werden.
Die Sortierung der Bakterienzellen zur Erfassung von Subpopulationen, die die Fusion in unterschiedlichem Ausmaß exemiten, in Verbindung mit der RNA-Seq-Analyse könnte genomweite Veränderungen im Transkriptom beleuchten. Achten Sie bei der Arbeit mit Formalin darauf, da es krebserregend ist und bei direkter Exposition Hautreizungen, allergische Reaktionen oder Augenschäden verursachen kann. Die Erzeugung mutierter Derivate von Stämmen, die fluoreszierende Reporter von Interesse tragen, kann helfen, die genetische Grundlage für die beobachteten räumlichen Regulierungsmuster aufzudecken.
